Реферат: BNP – мозговой натрийуретический пептид

BNP – мозговой натрийуретический пептид

Оглавление

История открытия BNP. Обзор семейства натрийуритических пептидов

Химическая природа BNP. Биосинтез, хранение и секреция

Синтез и процессинг proBNP

Транспорт НП (рецепторы натрийуретических пептидов)

Клиническое значение BNP (международные исследования)

Физиологическое действие BNP

Клиническое значение BNP

Терапия с использованием BNP

Заключение

Список литературы

История открытия BNP. Обзор семейства натрийуритических пептидов

(brain natriuretic peptide) - мозговой натрийуретический пептид - один из представителей семейства натрийуретических пептидов. Открытие BNPбыл впервые выделен из мозга свиньи в 1988 г. Для выделенного пептида была определена аминокислотная последовательность (26 АК) и показана высокая степень гомологии аминокислотной последовательности (70%) с уже известным к тому времени ANP. Выделенный пептид обладал вазорелаксирующими свойствами, увеличивал натрийурез и диурез, вызывал понижение давления. Было показано, что BNP оказывает стимулирующее действие на гуанилатциклазу различных тканей крысы. На гладкомышечных клетках аорты быка было показано, что BNP связывается с рецепторами, для которых ранее было показано связывание с ANP. Таким образом, было установлено, что BNP действует на клетки-мишени сходным с ANP образом - активируя внутриклеточную гуанилатциклазу.

В 1989 г. методом радиоиммунного анализа с использованием антител, полученных на BNP было показано, что BNP присутствует в плазме крови человека [1,С.257-260]. Дальнейшие исследования были направлены на установление аминокислотной последовательности BNP человека. Для этого была получена кДНК, кодирующая его предшественник (препрогормон), была определена нуклеотидная последовательность и по полученным данным предсказана аминокислотная последовательность предшественника BNP человека [2]. В 1990 г. из экстракта предсердий человека был выделен BNP [3]. Было установлено, что это пептид, состоящий из 32 АК. Кроме того, была установлена его аминокислотная последовательность, которая соответствовала С-концевому участку (с 77 по 108 АК) молекулы предшественника BNP, последовательность которого была предсказана по кДНК. В другом исследовании [4] было показано, что в предсердии человека кроме низкомолекулярной формы (4 кДа), соответствующей BNP, содержится также высокомолекулярная форма (13 - 15 кДа), соответствующая форме предшественника гормона - proBNP.

Вскоре были получены моноклональные антитела (МАт), специфичные к BNP человека [5], которые использовали в радиоиммунном анализе для измерения концентраций BNP в крови здоровых людей и людей с сердечной недостаточностью (СН). В этом исследовании было показано, что концентрация BNP в плазме людей с СН, увеличивается в зависимости от тяжести заболевания. Дальнейшие исследования были направлены на исследование возможности использования BNP в качестве маркера СН.

Кроме того, было показано, что N-концевой фрагмент молекулы предшественника натрийуретического пептида В (NT-proBNP) также может служить маркером данного заболевания. В последующие годы были разработаны иммунохимические методы измерения концентраций этих молекул в крови, которые используются в настоящее время в клинической практике для диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы, оценки степени тяжести заболевания и прогнозирования лечения [6,7].

Несмотря на схожесть ряда физиологических функций с другими членами семейства натрийуретических пептидов, он (BNP) обладает рядом самостоятельных функций, например, антипролиферативной в отношении компонентов соединительной ткани в сердце. В связи с этим появилась вероятность его использования в ряде патологических состояний для коррекции повреждений миокарда.. Некоторые из них имеют важное клиничекое значение и могут быть использованы в диагностических и терапевтических целях при заболеваниях сердечно-сосудистой системы [7].

Наиболее изученными из них являются ANP, BNP и CNP. Все они являются пептидными гормонами длиной в 28, 32 и 22 аминокислотных остатка, соответственно.

Хотя лучше всего известна важная роль, которую они играют в регуляции кровяного давления и гомеостаза сердечно-сосудистой системы, натрийуретические пептиды также оказывают влияние на многие виды тканей и разные системы органов. Вдобавок к их способности снижать объем крови ее давление через эффекты, оказываемые на почки и сосудистую систему, натрийуретические пептиды влияют на электрофизиологические явления в сердце, и на ЦНС, а также на сокращение гладких мышц в пищеварительной системе. Образование и поддержание структуры костей и мышц также находится под влиянием натрийуретических пептидов [8,9].

ANP и BNP - ключевые регуляторы гомеостаза водно-солевого баланса и поддержания периферического тонуса сосудов. Экспрессия и секреция ANP и BNP значительно увеличивается в ответ на патофизиологические стрессорные воздействия, такие как гипертония, гипоксия, инфекция, ишемия сердца, желудочковая гипертрофия, сердечная недостаточность и отторжение трансплантированного сердца [10].

Были разработаны радиоиммунологические и иммуносорбционные методы анализа, связанные с применением ферментов, для натрийуретических пептидов, которые сейчас широко применяются в качестве биомаркеров во многих клинических учреждениях, особенно при остром инфаркте миокарда и диагностировании сердечной недостаточности, а также для определения степени риска (стратификации) и контроля эффективности терапевтического лечения. Большинство методов анализа, используемых в клинических условиях на сегодняшний день, однако, не могут определить точно отдельные формы натрийуретических пептидов [11].

Химическая природа BNP. Биосинтез, хранение и секреция

Мозговой натрийуретический пептид

ВNP - полипептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков. Основные источники его синтеза - желудочки и предсердия сердца (в основном), а также головного мозг (в намного меньших количествах) [8,9].

Рис.1

Характерной особенностью семейства НП является кольцевая структура, состоящая из 17 аминокислотных остатков (АК), образованная дисульфидной связью между двумя остатками цистеина [12]. ANP человека состоит из 28 АК, BNP из 32 АК, СNP из 22 и 53 АК [13]. BNP и ANP секретируются кардиомиоцитами и являются эндокринными гормонами. CNP синтезируется клетками эндотелия и является паракринным гормоном [14]. Также показано, что ANP, BNP и CNP синтезируются нервной тканью и участвуют в нейроэндокринной регуляции [13].

Действие НП (натрийуретических пептидов) реализуется за счет связывания с мембранными рецепторами, обладающими гуанилатциклазной активностью, на поверхности клеток-мишеней, что приводит к повышению внутриклеточной концентрации циклического гуанозинмонофосфата (cGMP) и активации cGMP-зависимых реакций.

Структура гена BNP. Регуляция транскрипции

Ген BNP человека расположен на первой хромосоме, состоит из трех экзонов и двух интронов (Рис. 2) [15]. Характерной особенностью мРНК BNP является наличие на 3' конце нетранслируемого участка, состоящего из повторов AUUUAА. Этот участок придает молекуле РНК нестабильность, увеличивая тем самым скорость ее обмена, что приводит к импульсному характеру синтеза BNP [15].

Рис. 2

Регуляция секреции BNP происходит в основном на уровне экспрессии гена. Повышение давления на стенки сердца служит сигналом к синтезу мРНК BNP и дальнейшему выбросу BNP из сердца. Было показано, что основным местом синтеза BNP у человека являются кардиомиоциты желудочков сердца [16]. Кроме того, небольшое количество пептида синтезируется в кардиомиоцитах предсердий и может запасаться вместе с ANP в гранулах [17].

Ген BNP экспрессируется преимущественно в ткани сердца. Экспрессия в других тканях организма, таких как мозг, почки, печень, легкие, скелетная мускулатура, происходит в значительно меньшей степени и составляет всего 1-3 % от уровня экспрессии гена BNP в сердце.

При искусственно вызванном инфаркте у мышей уровень транскрипции гена BNP в области инфаркта увеличивается примерно в 5 раз в течение последующих 48 часов. Кроме того, он остается на увеличенном уровне в течение последующих 3-4 недель. Также было установлено, что регуляторные элементы, отвечающие за увеличение уровня транскрипции, находятся преимущественно в проксимальной области промотера гена BNP. Была показана связь увеличенной экспрессии гена BNP с последовавшей через 3 недели после инфаркта реконструкцией ткани желудочков (увеличением массы ткани, растяжением камер сердца).

В другой работе [18] было показано, что в течение короткого времени после искусственно вызванного инфаркта у мышей наблюдается заметное усиление экспрессии гена BNP в желудочках сердца. При этом заметное увеличение синтеза BNP начинается уже через 12 часов. Что значительно раньше, чем для ANP. Таким образом, при увеличении нагрузки на стенку желудочка происходит увеличение синтеза мРНК BNP и, как следствие, увеличение BNP в кардиомиоцитах желудочков сердца. При помощи иммуногистохимических методов было показано, что в самой области некротической ткани и вокруг нее выживают миоциты, синтезирующие большее количество BNP. После инфаркта миокарда BNP синтезируется в основном в желудочках сердца. При СН в ответ на увеличение нагрузки на стенки сердца BNP секретируется в кровоток значительно быстрее, чем ANP, что делает его более чувствительным маркером данного заболевания.

В работе [19] было показано, что уровень мРНК BNP в желудочках сердца человека составляет 52 % от соответствующего значения в предсердиях, однако, учитывая массы желудочков и предсердий, общее количество мРНК BNP в желудочках составляет 77 % от количества мРНК всего сердца. Таким образом, можно сказать, что желудочки являются основным местом синтеза BNP. Данное исследование проводили на сердцах, полученных при вскрытии 10 пациентов. Пациентами были 4 мужчины и 6 женщин в возрасте от 52 до 80 лет. Восемь пациентов страдали острой лейкемией, инфарктом мозга, раком кишечника, раком пищевода (2), раком желудка (2) и гепатомой, и двое пациентов страдавли заболеваниями сердца. Уровень мРНК BNP в ткани сердец больных с заболеваниями сердца был увеличен в 3-4 раза по сравнению с тканью сердец пациентов, не страдавших заболеваниями сердца. Регуляция экспрессии гена BNP может осуществляться также под действием нейрогормонов. Связывание таких нейрогормонов как эндотелин-I, ангиотензин-II и агонистов адренергических рецепторов с соответствующими рецепторами приводит к значительному увеличению экспресси гена BNP [20].

Синтез и процессинг proBNP

человека синтезируется в виде препрогормона, состоящего из 134 АК. Молекула preproBNP человека содержит гидрофобную сигнальную последовательность, состоящую из 26 аминокислотных остатков, которая отщепляется котрансляционно в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме до окончания синтеза С-концевой части молекулы прогормона. Молекулы proBNP (108 аминокислотных остатков) подвергаются дальнейшему процессингу с образованием физиологически неактивной N-концевой части (NT-proBNP) и биологически активной молекулы BNP (Рис. 3). Было показано, что в плазме человека присутствуют три формы пептида: BNP, proBNP и NT-proBNP [6]. Предполагают, что расщепление proBNP происходит в кардиомиоцитах либо непосредственно в момент секреции, либо перед секрецией в кровоток. Однако до конца этот вопрос не изучен.

Рис.3

Экспрессия гена proBNP характерна как для миоцитов предсердий, так и для миоцитов желудочков сердца человека [21]. Однако миоциты предсердий и желудочков значительно отличаются друг от друга по принципу хранения и секреции пептидов. В миоцитах предсердий присутствуют секреторные гранулы, содержащие как интактные молекулы proBNP, так и продукты расщепления молекулы предшественника. Миоциты желудочков сердца, напротив, не содержат таких гранул и продуктов расщепления proBNP. С другой стороны, есть некоторые данные о том, что при заболеваниях сердечно-сосудистой системы в желудочках также образуются секреторные гранулы, и в ткани присутствуют продукты расщепления proBNP. Кроме того, показано, что фибробласты сердца также синтезируют BNP [22]. Клетки коронарной сосудистой сети также экспрессируют ген BNP, по крайней мере, при коронарном атеросклерозе [23].

В работе [24] было показано, что основная часть иммунореактивного BNP, циркулирующего в крови больных с тяжелой стадией СН представляет собой proBNP. Как на эндотелиальных, так и на клетках гладких мышц сосудов было показано, что молекула proBNP обладает в 6-8 раз меньшей физиологической активностью по сравнению с BNP. Однако механизм, приводящий к увеличению содержания непроцессированной формы proBNP в кровотоке больных с тяжелыми формами СН до сих пор остается неясным. Процессинг proBNP в сердце до сих пор остается слабо изученным. Одной из основных причин этого является отсутствие хороших клеточных моделей in vitro. Неонатальные миоциты могут быть выращены в культуре в течение короткого периода времени, однако при этом не происходит их дифференцировка в зрелые клетки предсердий и желудочков [21].

Предполагают, что proBNP расщепляется эндопротеазой фурином, поскольку при СН показано одновременное увеличение экспрессии генов фурина и BNP. Кроме того, proBNP содержит мотив Arg-X-X-Arg в положении 73-76 АК, по которому происходит расщепление молекул предшественника фурином. Также было показано, что при ингибировании фурина in vitro процессинг proBNP блокируется [21].

Фурин является наиболее изученной протеазой, осуществляющей процессинг молекул предшественников. Ген фурина человека был установлен в 1989 году [25]. Этот ген был впервые охарактеризован как ген, ассоциированный с протоонкогенами c-fes/feps. Дальнейшее клонирование полной кДНК и экспрессия помогли установить гомологию фурина и Kex2 (субтилизиновая конвертаза).

Фурин является трансмембранным белком, представляющим собой кальций-зависимую сериновую протеазу с субтилизин-подобным доменом. Фурин экспрессируется повсеместно во всех тканях человека. С широкой распространенностью фурина в организме человека связана широкая специфичность данного фермента. Так, известны такие субстраты как факторы роста, гормоны, рецепторы клеток, факторы свертывания крови, металлопротеиназы, экстраклеточные белки, секретазы, бактериальные токсины и гликопептиды вирусов. Фурин присутствует в нескольких компартментах клетки, таких как транс-Гольджи сеть, эндосомы, плазматическая мембрана [25].

Также как и бактериальный субтилизин фурин синтезируется в форме зимогена (профермент), который превращается в активную форму фермента при протеолитическом отщеплении N-конца молекулы. Было показано, что фурин проходит две стадии расщепления, зависящие от рН [27]. В кардиомиоцитах предсердий BNP хранится в виде секреторных гранул, и секретируется при необходимости в ответ на внешние сигналы. proBNP может подвергаться расщеплению фурином в ТГС и затем храниться в предсердных секреторных гранулах. В желудочках, напротив, секреторных гранул не образуется, и proBNP, по-видимому, расщепляется непосредственно при выбросе в кровоток. Процессинг proBNP происходит более интенсивно в предсердиях, чем в желудочках. Так, отношение BNP/proBNP для предсердий и желудочков составляет 2:1 и 1:1, соответственно. Однако после инфаркта миокарда соотношение BNP/proBNP в желудочках составляет 3:1, что объясняется усилением экспрессии фурина в кардиомиоцитах.

В ткани сердца была обнаружена и охарактеризована также другая эндопротеаза - корин. Корин является сериновой протеазой, способной проводить протеолитическое расщепление in vitro proANP и proBNP [26]. Корин содержит трансмембранный домен, локализованный в мембране клетки, поэтому предполагается, что расщепление молекулы предшественника происходит в момент секреции гормона в кровоток. Таким образом, существует предположение, что корин может участвовать в процессе расщепления молекулы proBNP на BNP и NT-proBNP в ткани сердца. С другой стороны в настоящее время не существует данных о том, где происходит расщепление молекулы proBNP корином. Кроме того, процессинг proBNP и proANP в клетках предсердий различны. Так, показано, что секреторные гранулы предсердий содержат молекулы proANP и BNP [21]. Таким образом, активность корина не объясняет в полной мере процессов, приводящих к появлению физиологически активных молекул натрийуретических пептидов.

Корин является протеазой, осуществляющей процессинг ANP. При проведении точечных мутаций по 98, 101 и 102 Arg молекулы корина процессинга proANP не происходило, что позволяет предполагать, что корин-опосредуемый процессинг proANP обладает высокой специфичностью. В предыдущих исследованиях было показано, что корин является высокомолекулярной сериновой протеазой кардиомиоцитов. Было показано, что корин относится к типу II трансмембранных трансмембранных белков с внеклеточным каталитическим доменом.