Реферат: Бактеріальні біоплівки

Бактеріальні біоплівки

Зміст

Вступ

. Організація бактеріальних біоплівок та процес їх утворення

. Використання атомно силової мікроскопії для дослідження бактеріальних біоплівок

. Поширення біоплівок у природі

. Штучне вирощування біоплівок

5. Роль біоплівок у житті людини

. Стійкість біоплівкових бактерій до дії антибіотиків і стресових чинників

. Методи боротьби з біоплівками, які провокують хвороби

Висновки

Умовні скорочення

Список літератури

бактеріальний біоплівка мікроскопія антибіотик

Вступ

Аж до кінця минулого століття, тобто більше 150 років, мікробіологія розвивалася головним чином на основі досліджень чистих культур мікроорганізмів. Більше того, сприйняття бактерій як одноклітинних форм життя глибоко укорінилося саме завдяки дослідженням на чистих культурах. Оскільки бактерії можуть бути розсіяні до поодинокої колонії, що є потомством єдиної клітини, і потім вивчені в рідкій культурі, цей метод використовувався в ході більшості мікробіологічних досліджень.

Традиційний шлях культивування бактерій в рідкому середовищі сприяв вивченню бактерій і їх фізіології, проте зростання чистої культури в зваженому стані зустрічається в природі украй рідко. Нині більшість мікробіологів визнано, що більшість мікроорганізмів в природному і штучно створеному довкіллі існують у вигляді структурованих, прикріплених до поверхні співтовариств - біоплівок[8]. Ці природні співтовариства бактерій, оточені полісахаридним матриксом, функціонують як скоординированный консорціум [8]. Незважаючи на численні спостереження зростання бактерій у вигляді біоплівок, загальна теорія переважання біоплівок мікроорганізмів над їх вільноживучими формами була визнана лише в 1978 р [8]. Згідно цієї теорії, бактерії основну частину часу розвитку і розмноження знаходяться в матриксібіоплівки, прикріпленої до поверхонь багатих поживними речовинами екосистем, і ці прикріплені клітини фізіологічно відмінні від клітин того ж штаму, у планктонному стані [2]. Загалом, планктонну стадію можна розглядати лише як спосіб переміщення мікробної клітини від однієї поверхні до іншої, тобто короткочасний стан в житті бактерій.

. Організація бактеріальних біоплівок та процес їх утворення

На сьогоднішній день відомо, що 99% бактерій існує не у вигляді вільно існуючих клітин, а у вигляді прикріплених до субстрату біоплівок. Враховуючи те, що жодного виду бактерій не описано у вигляді окремо існуючих клітин, деякі дослідники вважають, що окремо існуючі бактеріальні клітини насправді є мігруючими клітинами, які пізніше дадуть початок новій біоплівці.

Біоплівка, як така є мікробним співтовариством, яке характерне клітинами, прикріпленими до поверхні, або одна до одної. Ці клітини знаходяться всередині матриксу, утвореному самими клітинами. Бактерії біоплівки характерні зміною фенотипу, що виражається зміною параметрів росту та експресією специфічних генів. За цими параметрами біоплівки відрізняються від інших мікробних співтовариств, наприклад колонії бактерій на поверхні агару, якій не властива жодна з цих ознак.

Виникнення і функціонування біоплівок є прикладом складної соціальної поведінки бактерій. Біоплівки регулюються не лише елементами навколишнього середовища, а ще й міжклітинними взаємодіями. Відомо, що для біоплівок характерний феномен кворумної сигналізації (QuorumSensing), який координує експресію генів залежно від зовнішніх умов.

Цей тип міжклітинних взаємодій і виникнення біоплівок є визначним у взаємодії бактерій з рослинами та тваринами. Переваги колективної взаємодії бактерій визначаються глибокими змінами в метаболізмі бактеріальних клітин при досягненні ними критичної щільності. Вперше це було доведено на прикладі бактерій Vibriofisheri. Ефект біолюмінісценції спостерігався лише за високої щільності культури, але може бути викликаний і в культур низької щільності за умови їх контакту з безмікробною рідиною, в якій попередньо вирощувалися біолюмінісцентні бактерії. Було встановлено, що гени, які викликають біолюмінісценцію контролюються молекулами, які продукують самі бактерії і працюють за принципом ауто індукторів (АІ). Біолюмінісценція реєструється за наявності високої концентрації молекул АІ, яка досягається високою щільністю бактерій( >10⁷ КОЕ/мл). Аутоіндукція специфічних генів відбувається завдяки наявності двох білків:

. білку Lux1, що бере участь у біосинтезі сигнальних молекул АІ, та

. білкуLuR, що здатний зв’язуватися з молекулами АІ та активувати транскрипцію оперонів та генів.

За тим же принципом (QS) регулюється широкий спектр фізіологічних процесів, включно синтез детермінант вірулентності у патогенних бактерій, перенос коньюгативних плазмід, утворення біоплівок.

Утворення біоплівок забезпечує виживання бактерій не лише у навколишньому середовищі, а й в організмі людини та тварин. Біоплівки можуть утворюватися не лише одним, а й кількома видами. Ключевим структурним компонентом біоплівок є матрикс (позаклітинна полімерна речовина), в той час, як самі бактерії складають лише 5 - 35% маси біоплівки.

До складу матриксу входять: ліпополісахариди, глюкопротеїди, протеоглікани, нуклеїнові кислоти та речовини, аналогічні складу клітинних стінок бактерій. Через матрикс проходять канали, якими транспортуються поживні речовини, продукти метаболізму, і кисень.

Початком утворення біоплівки є прикріплення бактерій до біотичної чи абіотичної поверхні, яке відбувається завдяки пілям. Наприклад, колонізація кишечника холерними вібріонами визначається Тср-пілями, а прикріплення до абіотичної поверхні - пілями, які кодуються локусом msh, який не є фактором патогенності. Перехід бактерій від планктонного існування до існування у вигляді біоплівок ініціюються сигналами з навколишнього середовища, причому ці сигнали можуть відрізнятися не лише для окремих видів, а й навіть для окремих штамів. Наприклад, штамE.coli 0157:H7 утворює біоплівки лише у випадку недостачі поживних речовин, а штамE.coli K12 - лише при додаванні до поживного середовища амінокислот.

Після фіксації наступає стадія достигання 1, під час якої прикріплення клітин стає необоротним, клітини втрачають рухливість, утворюються мікроколонії, шар біоплівки потовщується. Під час стадії достигання 2 виникають кластери мікроколоній максимальної щільності. Через 9 днів після початку утворення біоплівки структура кластерів змінюється і починається останній етап - розпад біоплівки. Розпад матриксу відбувається завдяки впливу ферментів (наприклад, полісахаридліаз), які декретуються бактеріями. Цикл розвитку біоплівки завершується виходом бактерій через відриті канали і їх поверненням до планктонного способу життя.

Вважається, що феномен колективної поведінки бактерій забезпечується різними олігопептидними сигнальними молекулами, за допомогою яких клітини контактують одна з одною і утворювати біоплівки. Наприклад, механізм утворення біоплівки грам позитивними бактеріями такий: спочатку синтезується попередник сигнального пептида, який потім модифікується, перетворюючись на сигнальний олігопептид.

Цей пептид транспортується з клітини за допомогою білкового комплексу (АВС-траспортеру) у міжклітинний простір. Коли досягається певна концентрація цього пептиду в міжклітинному просторі, фермент гістидинкіназа об’єднується з ним і утворює комплекс гістидинкіназа-пептид, який ініціює процес каскадного фосфорилювання.

Цей процес призводить до формування комунікативних реакцій бактерій, їх об’єднанню і утворенню біоплівки. У 2009 році професор Т. Вуд (Thomas K. Wood) зі співробітниками хімічної інженерії Техасського університету припустив, що виникнення біоплівок базується на фагових генах. Це припущення було зроблено на основі таких даних: коли фаг проникає у клітину, бактерії вбудовують його ДНК у свої хромосоми. Новий генетичний матеріал дозволяє бактеріям не лише вижити, а й бути більш життєздатними ніж такі самі бактерії, які не включили в свій генетичний матеріал ДНК фагу.

Бактерії мають білок Hha, який контролює збереження вірусних генів у бактеріях. Коли Hha "увімкнений" бактерії позбавляються вірусного геному, стають рухливими і нездатними утворювати біоплівки. Коли ж Hha "вимкнений", бактерії втрачають рухливість і утворюють біоплівки з високою швидкістю.

Рис. 1. Біоплівка, або колективна форма життя мікроорганізмів

Рис. 2. Життєвий цикл біоплівки. 1 - прикріплення бактерії до поверхі; 2 - ріст колонії і продукування міжклітинного матриксу; 5 - вихід вільних бактерій з колонії.

2. Використання атомно силової мікроскопіїдля дослідження бактеріальних біоплівок

Біоплівки відомі ще здавна. Спочатку їх досліджували за допомогою світлового мікроскопа. Завдяки цьому методу дослідження було встановлено структуру біоплівок, види бактерій, які їх утворюють, щільність колоній, і було описано методи їх утворення і розвитку. Пізніше за допомогою використання біохімічних методів дослідження, стало відомо про біохімічний склад біоплівок і досліджено механізми їх утворення та взаємодії бактерій між собою всередині біоплівки. Використовуючи атомно-силову мікроскопію досліджують особливості структури поверхні як окремих бактерій, так і їх асоціацій. Використовуючи деякі комп’ютерні програми, наприклад програми "Nova" можна данні переводити у дво- та тривимірні формати, а також редагувати отримані дані.

Сучасні методи дослідження біоплівок з використанням мікроскопічної техніки спрямовані на вивчення позаклітинного матриксу, його фізичних, біохімічних та топографічних властивостей.

Напівконтактний метод використовують для отримання дво- і тривимірного топографічного зображення бактерій, вимірювання розмірів клітин (довжину, ширину, висоту), а також структуру поверхні клітин. Досліджуючи цим методом біоплівки, утворені бактеріями S. aureus було встановлено, що бактерії, які входять до складу цих біоплівок характеризувалися поліморфізмом, спостерігалися тяжі. Також було досліджено шершавість бактеріальних клітин, яка характеризує наявність S-шару на поверхні мікроорганізмів. S-шар виконує функції збереження форми клітин, захисту від впливу агресивних чинників навколишнього середовища, взаємодії з іншими клітинами.

Метод розузгодження заснований на реєстрації амплітуди коливань кантилевра під час сканування поверхні об’єкту. За допомогою цього методу можна виявити тонкі деталі ультраструктури біоплівки, зокрема позаклітинний матрикс, його розмірність, досліджуються джгутики і пілі бактерій та встановлюється їх розмірність.

Метод відображення фази чутливий до взаємодії кантиливер - об’єкт, що сприяє дослідженню механічних, хімічних, топографічних і гетерогенних властивостей досліджуваного об’єкту досліджень. Цей метод показує залежність дисипації енергії (перехід кінетичної енергії коливань зонда в енергію електричного струму) коливань кантиливера від адгезивної взаємодії між кантиливером й поверхнею об’єкта досліджень. При дослідженні біоплівок цим методом реєструють зміну амплітуди та зрушення фази коливань кантиливера. Фазові зображення мають у своєму складі темні і світлі пікселі. Зміни фази коливань кантиливера пов’язані із взаємним розташуванням клітин мікроорганізмів та матрикса, різницею їх лінійних розмірів, жорсткості й адгезивності.

Для збільшення візуальної чіткості зображення, контрастування локальної неоднорідності, виділення границі об’єкта, застосовують комп’ютерні програми, зокрема програму "Nova". Також для збільшення чіткості застосовують метод співставлення зображень.

Рис. 3АСМ-зображення клітин S. aureus: а - напівконтактний метод; б - метод розузгодження; в - метод відображення фази. Стрілкамипозначено: а, б - бактерії; в - позаклітинний матриксбіоплівкиS. aureus.Розмірзображеннь 20 х 20 мкм

Рис. 4АСМ-зображення клітинE. coli: а - напівконтактний метод; б - метод розузгодження; в - метод відображення фази. Стрілкамипозначено: а, б - бактерії; в - позаклітинний матриксбіоплівкиE. Coli

Рис. 5 Профіль фазового зрушення на вибраній ділянці зображення. а - E. coli; б - S. aureus.По осіабсцис - довжина в мкм, по осі ординат - градуси

. Поширення біоплівок у природі

Оскільки біоплівки є основною формою існування бактерій, вони поширені усюди, де є бактерії. Біоплівки можуть виникати на будь-якому матеріалі, який контактує з вологою. Будь-яка поверхня, як біогенного, так і абіогенного походження, яка заселяється бактеріями, з часом обростає біоплівками. Фактично будь який слиз, який утворюється на поверхні абіогенного матеріалу, являє собою біоплівку. Деякі біоплівки мають корозійні властивості. Наприклад виникнення корозійних біоплівокна дні кораблів, пришвидшують руйнування цих поверхонь, тому необхідні методи боротьби з біоплівками. Біоплівки поширені на поверхні коренів, плодів, шкірі тварин, в ротовій порожнині, всередині кишечнику… Біоплівки на поверхні медичних імплантатів здатні викликати захворювання. Класичним прикладом біоплівки є тонкий наліт на скелях, які знаходяться посеред течії. На рідких поверхнях біоплівки можуть бути у вигляді плавучих матів. Окрім бактерій, біоплівки можуть утворювати мікроскопічні гриби, найпростіші й водорослі.

У природних екосистемах біоплівка - майже незмінно багатовидове мікробне співтовариство, де кожен мікроорганізм знаходиться у власній мікроніші в єдиному матриксібіоплівки, тому більш розповсюдженими є багатовидові біоплівки, але одно видові біоплівки є більш цікавими для вивчення мікробіологами, оскільки дають можливість дослідити їх використання у промисловості, або знайти метод боротьби зі шкідливими видами бактерій.

Біоплівки, утворені бактеріями нормо флори конкурують за місце існування із патогенними і умовно-патогенними бактеріями. За нормальних умов такі біоплівки не дають можливості розвитку патогенної мікрофлори. Мікробні інфекції людини, тварин і рослин супроводжуються формуванням біоплівок. Вони перешкоджають нормальній імунній відповіді макроорганізму, пригнічують активність макрофагів, тим самим, призводять до затяжного перебігу хвороби, неефективності антибактеріальної терапії.

В природних і штучних умовах біоплівки захищають бактерій від дії антибактеріальних речовин, бактеріофагів, найпростіших, високих температур, ультрафіолетового випромінювання, радіації, дегідратації, фагоцитозу, зміни Рн середовища. Збудники інфекцій утворивши біоплівку, характеризуються підвищеною стійкістю до дії антибіотиків, протидіють антитілам і фагоцитам. Біоплівки також потрібні мікробному світу для того, щоб адаптуватися до умов довкілля, що міняються, вони беруть участь у синтезі білків, полісахаридів, глікопротеїдів.

Рис. 6 АСМ-зображення поверхні біоплівки ризобактерій, отримане при скануванні в напівконтактному режимі

Рис. 7 Зовнішній вигляд біоплівки

. Штучне вирощування біоплівок

Аж до кінця минулого століття, тобто більше 150 років, мікробіологія розвивалася головним чином на основі досліджень чистих культур мікроорганізмів. Більше того, сприйняття бактерій як одноклітинних форм життя глибоко укорінилося саме завдяки дослідженням на чистих культурах. Оскільки бактерії можуть бути розсіяні до поодинокої колонії, що є потомством єдиної клітини, і потім вивчені в рідкій культурі, цей метод використовувався в ході більшості мікробіологічних досліджень.

Але дослідивши колективну поведінку бактерій, і почавши досліджувати біоплівки, з’явилася необхідність їх штучного відтворення для дослідження їх властивостей і методів боротьби з ними, та дослідити можливість використання їх у промисловості. Утилізація побутових відходів, очищення води і ґрунту, виробництво ліків, вітамінів, продуктів, біологічна боротьба з фітопатогенами - це сфери можливого застосування мікробних співтовариств. Біоплівки також спонукають дослідників до створення штучних біоплівок для запакування харчових продуктів. Перспектива їх використання у тому, що на відміну від синтетичних плівок, вони здатні розкладатися після використання.