Реферат: Бактеріальні біоплівки

Сучасна біотехнологія дозволяє використовувати оптимальне співтовариство мікроорганізмів для виконання ряду функцій. Це актуально у використанні продуктів, ліків, харчових добавок, очищення води від забруднення нафтопродуктами. Такі співтовариства ще називають консорціумами мікроорганізмів.

За останні 10 років значно розширилися можливості вивчення формування мікробних біоплівок. Головний напрям цих досліджень пов'язаний з розробкою методів культивування мікроорганізмів в динамічних (імітація природніх умов утворення біополів ок) і статичних умов. Суть динамічних методів полягає в інокуляції бактерій в планктонній формі в рідкомупоживному середовищі, циркулюючі в закритій системі (лабораторні ферментатори). Серед цих методів найбільшвідомим є культивування мікроорганізмів в апараті Робінсона. Цей апарат забезпечує постійне надходження поживного середовища, яке стикається з пластинами на поверхні яких знаходяться адгезовані мікробні клітини. За умов постійного доступупоживних речовин і аерації утворюється біоплівка.

Прикладом статичного методу вивчення утворення біоплівок є культивування мікроорганізмів в 96-лункових пластикових планшетах. Суть методу: суспензію бактерій вносять в лунки планшета і після інкубації в оптимальних умовахпланктонна фаза популяції бактерій видаляється разом з поживним середовищем, а біоплівку, що утворилася виявляють, різними методами. Наприклад, до методів, які візуалізують структуру мікробних співтовариств ідозволяють ідентифікувати мікроорганізми у складі біоплівок, слід віднести електронну, конфокальну, лазерну, скануючу мікроскопію, метод флюоресцентної гібридизації insitu. Проте слід підкреслити, що всі вище перераховані методи застосовуються нині тільки для наукових досліджень і не адаптовані для використання в практичній діагностичній роботі. У зарубіжній практиці розроблені і стандартизовані методи виявлення біоплівок лише для невеликого числа клінічно важливих видів мікроорганізмів.

. Роль біоплівок у житті людини

Біоплівки можуть виникнути в організмі людини як внаслідок життєдіяльності нормофлори, так і внаслідок діяльності умовно-патогеннної і патогенної мікрофлори. Бактеріальні біоплівки виявлені у ротовій порожнині, у кишечнику, на поверхні шкіри. Корисні мікроорганізми утворюють організовані співтовариства, так само, як і шкідливі мікроорганізми. Наприклад, корисна мікрофлора кишечника відповідальна за активність імунітету, лактобактерії вагінального середовища перешкоджають інфікуванню плоду під час нормального ходу вагітності. Крім того, сапрофітні бактерії мають здатність перешкоджати адгезії і колонізації патогенних мікроорганізмів.

Однак, на даний момент вивчена роль і значення бактеріальних біоплівок у етіології та патогенезі багатьох гострих, і особливо, хронічних бактеріальних інфекцій людини. До таких захворювань відносять інфекції сечових шляхів, інфекції середнього вуха ( H.influenzae), муковісцидоз, кістозний фіброз (P.аeruginosa), інфекційний ендокардит, інфекції протезних клапанів, катетор-асоційовані інфекції кровоточу (коагулазопозитивні і коагулазонегативні стафілококи) та стоматологічні проблеми (карієс, парадонтит, гінгівіт). Враховуючи опубліковані дані, частота інфекцій, зумовлених біоплівкою, складає 65 -80%.

Нині доведена участь біоплівок вконтамінації медичних імплантатів. Найчастішебіоплівки формуються на катетерах (серцевих, вну-трішньовенних, сечовивідних), штучних клапанахсерця (будучи головною причиною інфекційних эндокардитів), штучних суглобах, контактних лінзах(часто будучи причиною кератитів). Хронічні інфекції імплантованих медичних пристроїв можуть призвести до розвитку сепсису і смерті пацієнтів, особливо у осіб з ослабленим імунітетом, тому розвиток мікробних біоплівок на синтетичних імплантатах є великою проблемою для їх успішного впровадження і ефективного функціонування. Видовий склад біоплівок переважно представлений:S.aureus, Enterococcus, Streptococcus, KlebsiellaPseudomonas, E.coli. Крім того, багато патогеннів, як, наприклад Salmonella, E.coli, Y.enterocalitica, Listeria, Campylobacter, існують у вигляді біоплівок на поверхні харчових продуктів або на поверхні устаткування для їх зберігання.

Сучасні уявлення про роль біоплівок ветіопатогенезі гострих і особливо хронічних інфекційних захворюваннь вимагають абсолютно нових підходів до їх діагностики і лікування. Стає очевидним, що для підвищення ефективності лікування інфекцій асоційованих з біоплівками, потрібно визначати не лише антибактеріальні характеристики анти-біотиків, але і їх здатність перешкоджати адгезіїбактерій, проникати у біоплівки, пригнічувати їх утворення, або сприяти дезорганізації позаклітинного матриксу.

Стає очевидним, що сучасні уявлення про роль біоплівкових бактерій в інфекційній патології людини передбачають зміни підходів до лікування захворювань, асоційованих з біоплівками, оскільки традиційна антибіотикотерапія не дозволяє розв'язати цю проблему.

Рис. 7 Зубний наліт, як приклад біоплівки ротової порожнини

Рис. 8 БіоплівкаS.epidermidis з клапану серця при інфекційному ендокардиті

. Стійкість біоплівкових бактерій до дії антибіотиків і стресових чинників

Резистентність біоплівкових бактерій до стресових дій обумовлена рядом чинників:

. зниженням можливості проникнення антибактеріальних препаратів всередину біоплівки. Це пов'язано з тим, що матрикс біоплівки, яким оточені бактериальні клітини, може зв'язувати або не пропускати, і/абоінактивувати антибіотики. Наприклад, аминоглікозидні антибіотики повільно проникають у біоплівки, утворювані псевдомонадами, оскільки зв'язуються полісахаридними компонентами матриксу. Встановлено що у біоплівки, утворені K.pneumoniae, погано проникає ампіцилін, а утворені E.faecalis - ампіцилін, котримаксозол, ванкоміцин. Полісахаридний матрикс, утворені S.aureus і S.epidermidisзнижує антибактеріальний ефект глікопептидів (ванкоміцина та тейкопланина) і β-лактамів (оксациллина та цефотаксима). Інактивація антибіотиків продемонстрована на прикладі біоплівкових бактерійP.aeruginosa,що мають підвищену здатність продукувати β-лактомазу;

. відмінностями в метаболічній активності бактеріальних клітин, що утворюють біоплівки. Виявилось, що напериферії біоплівок знаходяться метаболічно активніклітини, а усередині - метаболічно неактивні. Оскількивідомо, що мішенями дії антибіотиків єактивно зростаючі клітини, то клітини, які знаходяться усередині біоплівокє захищеними від дії антибіотиків;

. зменшенням вільної поверхні бактерій за рахунок контактів однією з одною, формуванням популяцій мікробних клітин, що залишилися життєздатними післядії антибіотиків і здатних до персистенції. Ці клітини, що дістали назву персистори, виявилися стійкі практично до усіх антибактеріальних препаратів. Кількість персисторів у біоплівках різного походження варіює від 1 до 10 %.

Відомі також генетичні чинники, відповідальні за рівень стійкості біоплівкових бактерій до стресових умов. Наприклад, ген ndvBекспресується тільки біоплівковими клітинами P.aeruginosa, а мутації цього гена роблять біоплівку на порядок чутливішою до дії антибіотиків в порівнянні з дикими штамами. Можливість утворення біоплівки B.subtilisвизначає білок DegU, а білок SasG, розташований на поверхні S.aureus, разом з іонами цинку, потрібний для побудови біоплівки. Білок CagDE.coli активує зростання фімбрій і синтез позаклітинних полісахаридів, сприяючи утворенню біоплівок.

Наведені механізми резистентності біоплівкових бактерій до антибактеріальних препаратів, дозволяє їм зберегти життєдіяльність при концентрації антибіотиків в десятки й сотні разів більших, ніж ті, що пригнічують планктонні форми.

Особливий інтерес представляє антибиотикорезистентність полі мікробних біоплівок не лише тому, що ізоляти різних видів бактерій, що утворюють біоплівку, несуть різне поєднання генів резистентності, але і тому, що здатні передавати ці гени одне одному в умовах тісного контакту всередині біоплівки. Наприклад, показана можливість передачі генів стійкості до ванкоміцину (van A) і тетрацикліну (tet S, tetU) від E.faeciumкдоS.aureus.

Табл.1 Порівняння антибіотикорезистентності планктонних і біоплівкових бактерій

. Методи боротьби з біоплівками, які провокують хвороби

Терапевтична дія на біоплівки може бути спрямована на механізми первинної адгезії бактерій до поверхні, блокування синтезу або руйнування полімерного матриксу, порушення міжклітинного обміну інформацією, а також воно може поєднуватися з власне бактерицидними агентами. Подібне лікування, що діє на структуру або функції біоплівок, може виявитися більше ефективним, ніж стандартна антибактеріальна терапія.

Одним з перспективних методів є поєднане застосування етіотропного антибактеріального препарату в комбінації з кларитроміцином (антибіотик з групи макролідів). Детальне вивчення механізму дії препарату кларитроміцин на утворення біоплівки, дозволило виявити, що структура біоплівки змінюється, зменшується кількість альгінату, гексози, глікокалікс стає тоншим, тим самимпідвищується проникнення антимікробного препарату, який використали для пригнічення синьо гнійної палички в даному дослідженні - фторхінолону. Ефективність фторхінолона виявилася значно вища у присутності кларитроміцину, що привело до ерадикації синьогнійної палички. Проводилися також клінічні дослідження на хворих з муковісцидозом і дифузним панбронхіолитом, в ході яких булопоказано спільне використання для дії на синьогнійну паличку кларитроміцина з етіотропними антибіотиками.

Виявлена нова мишень- позаклітинна ДНК матриксубіоплівок для дії на бактерії з ціллю підвищення ефективності антибіотикотерапії. Використання ДНК матриксу, як додаткової мішені при терапії, дозволяє підвищити ефективність дії різних антибіотиків нанеспоріднені мікроорганізми, що знаходяться у біоплівках, знизити вірогідність виникнення, поширення і збереження стійкості до лікувального агента, скоротити загальну тривалість терапії і знизити частоту рецидивів захворювання.

Способів поліпшення проникнення у біоплівку антимікробних препаратів може бутиудосконалення форм їх доставки. Відомо, що ліпосомальний комплекс амфотерицина B володіє вираженою активністю по відношенню до резистентних біоплівок, які виникають внаслідок діяльності Candidaspp., щодозволяє використати його при інвазивних системних мікозах.

При комбінованому застосуванні лактоферина та антибіотикаципрофлоксацина, формування біоплівки, викликане діяльністю P. Aeruginosa значно знизилося.

Авторами дослідження Скоробогатих, Ю.І, Перуновою Н.В, Курлаевим П.П також вивчався вплив на процес утворення біоплівокципрофлоксацина, але в комбінації з окситоцином. Проводилися експериментальні дослідження на моделяхinvitroта invivo комбінації окситоцину і ципрофлоксацину на біоплівкоутворення представників умовно-патогенної мікрофлори, отриманої з гнійних ран (грампозитивних - Staphylococcusaureus, S. epidermidis, грамнегативних паличок -Escherichiacoli, Klebsielapneumoniae, Pseudomonasaeruginosa і облігатно-анаеробних мікроорганізмів - B. Fragilis). На моделі invitro автори застосовували 1/2 мінімальної концентрації, необхідної для пригнічення мікроорганізмів,окситоцину і ципрофлоксацина, при цьому утворення біоплівок пригнічувалося на35-57% в порівнянні з контролем. Особливо ефективною ця комбінація виявилася для E.coli, K.pneumoniae та P.anaerobus. Експериментальні дослідження invivo підтвердили більш високу ефективність місцевого застосування комбінації ципрофлоксацина з окситоцином на гідрофільній основі, в порівнянні звикористанням в лікуванні гнійних ран ципрофлоксацину або окситоцинуокремо, що виражалося у більш ранніх термінах очищення ран, появі крайової епітелізації і нормалізаціїпоказників периферичної крові. В1-й групі тварин (комбінація ципрофлоксацина з окситоцином) на3-й та 5-й день лікування, посіви з раневого секрету не культивувалися в 91,7% випадків, тоді яку тварин 2-ї, 3-ї та 4-ї груп цей показник був на рівні 50-58,4% і менше. Застосовуючи світлову мікроскопію для дослідження патологічного матеріалу, отриманого з ран на1 добу, виділені одиничні скупчення мікробних клітин без ознак біоплівкоутворення у щурів усіх досліджуваних груп. При проведенні лікувальних заходів на 3-й - 5-й добі відзначалася повна відсутність мікробних біоплівок в рані у 83,3-91,7% щурів1-ї групи, тоді як в 2-й групі (монотерапія антибіотиком) цей показник складав 50-66, 7%. Лікування щурів одним окситоцином практично не впливало на утворення біоплівок бактеріями: мікроскопічне дослідження патологічних зразків з ран пацюків 3-ї групи було схоже з контрольною групоющурів (що не отримували лікування) і виявило в усіх тварин наявність зрілих біоплівок, які займають велику частину поля зору.

Досить цікаві результати отримані дослідниками О.В. Бухаріним, Л.Н. Чуркіною, Н.Б. Перуновою. Виділенийзі штаму ґрунтової бактерії Pseudomonasbatumici антибіотик батумін, за даними авторів, в 1/2 мінімальній концентрації, необхідної для пригнічення мікроорганізмів, показав високу ефективність в пригніченні біоплівок утворених стафілококами з високим рівнем біоплівкоутворення. І навпаки, у штамів з низькими показниками біоплівкоутворення було відмічено посилення утворення біоплівок під дією батуміну. Аналогічні результати дослідники отримали при дослідженні біоплівкоутворення Candidaalbicans. У грамнегативних мікроорганізмів препарат стимулював біоплівкоутворення лактозо позитивних не гемолітичних ешеріхій незалежно від початкового рівня біоплівкоутворення.

Висновки

Отже бактеріальні біоплівки являють собою організовані співтовариства мікроорганізмів, які складаються з позаклітинного матриксу, виробленому самими мікроорганізмами і власне занурених у нього мікроорганізмів. Всередині біоплівки мікроорганізми живуть і розмножуться, такий спосіб існування захищає мікроорганізми від несприятливих впливів навколишнього середовища (хімічних, фізичних, біологічних). Існування бактерій всередині біоплівки є більш вигідним, ніж у планктонному стані.

Біоплівки поширені всюди, де є мікроорганізми, як на об’єктах живої природи (на поверхні шкіри, в ротовій порожнині, у кишечнику…), так і неживої (на камінні, у ґрунті…). Вони можуть утворюватися як на твердих поверхнях, так і на поверхні рідин. На даний момент невідомо жодного виду бактерій, який би не утворював біоплівки.

Оскільки бактерії біоплівки захищені від впливу несприятливих умов, виникають значні труднощі у лікуванні хвороб, спричинених бактеріями, які утворили біоплівку. Такі бактерії захищені від дії антибіотиків, макрофагів та антигенів, тому хвороби, спричинені такими мікроорганізмами потребують іншого методу лікування, спрямованого на знищення матриксу біоплівки, а потім вже і самих мікроорганізмів. Тому для лікування хронічних інфекцій варто застосовувати комплекс препаратів.

Біоплівки несуть не лише шкоду, корисна мікрофлора теж утворює біоплівки. Дослідження біоплівок створює перспективи подальшого використання їх у промисловості, тому створюються методи для їх штучного вирощування з метою їх кращого вивчення.

Умовні скорочення

АСМ - атомно силова мікроскопія

АІ - ауто індуктор

Список літератури

1.Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка - "город микробов" или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. 2007. Т. 76. № 2. С. 149-163

. Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш. Что такое биопленка?//В чем секрет выживания патогенних бактерий в условиях воздействия антибактериальных препаратов? 2013 С. 86-89

. Афиногенова, А.Г. Микробные биоплёнки ран: состояние вопроса/ А.Г. Афиногенова, Е.Н. Даровская// Травматология и ортопедия России.- 2011.- №3.- С. 119-125.

. Бухарин, О.В. Влияние антистафилококкового антибіотик абатумина на биоплёнкообразование микроорганизмов/О.В. Бухарин, Л.Н. Чуркина, Н.Б. Перунова// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.- 2012.- №2.- С. 8-12.

. Скоробогатых, Ю.И. Экспериментальное изучение комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на образование биоплёнок условнопатогенными бактериями/ Ю.И. Скоробогатых, Н.В. Перунова, П.П. Курлаев// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.- 2010.- №6.- С. 3-7.

. Честнова, Т.В. Современные представления о физико-химических особенностях существования бактерий в составе биоплёнок. / Т.В. Честнова, Н.В. Серёгина// Общественное здоровье и здравоохранение: профилактическая и клиническая медицина// XXXXV научно-практическая конференція профессорско-преподавательского состава ТулГу/ ТулГУ, 2009.- С. 138.

. Шуб, Г.М. Материалы к элективному курсу"Микробныесообщества" /Г.М. Шуб, И.Г. Швиденко, Е.А. Пронина, Н.В. Белобородова// Саратовский научно-медицинский журнал.- Том6.- 2010.- №2.- С. 245-247

. Байрамов И. Т., Белобородова Н.В.МИКРОБНЫЕ БИОПЛЕНКИ

. Саакян С. Биопленка: друг или враг? Бактерии на поверхности плодов, 2012

. Николаев Ю.А., Плакунов В.К.Микробные биопленки: перспективы использования при очистке сточных вод// Вода: химия и екология. - 2008 - №2. С. 11-13.

. Хренов П.А., Честнова Т.В. ОБЗОР МЕТОДОВ БОРЬБЫ С МИКРОБНЫМИ БИОПЛЁНКАМИПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ//ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ. - 2013 - №1.

.Чернявский В.И. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БИОПЛЕНКИ И ИНФЕКЦИИ (ЛЕКЦИЯ)//AnnalsofMechnikovInstitute. - 2013 -№1. С. 86-90

. Chebotar I.V. etal. AntimicrobialResistanceofBacteriain. ClinicalMicrobiologyandantimicrobial chemotherapy.-2012,-v.14,-p.51-58.

. Costerton J.M. etal. Bacterilbiofilms: a commoncausepersistensinfection. Science. -1999,-v.284,-p.1318-1322.

. Donlan R.M. etal. Biofilms : survivalmechanismsofclynicallyrelevantmicroorganism. Clin.Microbiol.Rev.2002,-v.15,-p.167-193

. Golub A.V. BacterialBiofilms - a NewTherapeuticTarget? Clinicalmicrobiologyandantimicrobialchemotherapy. 2012,-v.14,-Ν.1.-p.23-29

16. Jakobsen T.H. etal. Qualitativeandquantitativedeterminationofquorumsensinginhibitioninvitro. Quorumsensing: methodsandprotocols. MethodsinMolecularBiology. 2011.-v.692.-p.253-263

. Tetz V.V. etal. Extracellularphospholipidsofisolatedbacterialcommunities. Biofilms.2004.-v.1.p.149-155.