Статья: Биохимические изменения крови крыс линии Wistar при экспериментальной BLV-инфекции

Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова

Биохимические изменения крови крыс линии Wistar при экспериментальной BLV-инфекции

Е.С. Красникова

A.B. Красников

Р.В. Радионов

Д.А. Артемьев

В.И. Околелов

Аннотация

Установлено, что белые крысы аутбредной линии Wistar восприимчивы к пероральному заражению вирусом лейкоза крупного рогатого скота. При скармливании крысам молока BLV- инфицированных и больных лейкозом коров в их организме выявляют патогномоничные для лейкоза изменения: неоплазию на внутренних органах, а также явления гиперплазии, аденокарциномы, мастоцитомы и фибросаркомы в селезенке. Биохимические исследования сыворотки крови крыс выявили прогрессирующие признаки интоксикации, эндокринных нарушений и развития злокачественных процессов независимо от того, молоко инфицированных или больных лейкозом коров им скармливали. Ярко выраженные признаки поражения печени, почек и миокарда были отмечены у потомства экспериментальных животных.

Ключевые слова: лейкоз, крупный рогатый скот, крысы аутбредной линии Wistar, патогномоничные изменения в органах, биохимические показатели крови.

Abstract

лейкоз крыса корова патогномоничный

It is founded that аn outbred Wistar line rats are susceptible to oral infection with bovine leukemia virus. Pathognomonic for leukemia changes such as neoplastic processes, as well as hyperplasia, adenocarcinoma, mastocytoma and fibrosarcoma in spleen were revealed in rats, when feeding them milk of BLV-infected and affected with leukemia cows. Progressive signs of intoxication, endocrine disorders and development of malignant processes were revealed by biochemical studies of the rats' blood serum, regardless of whether the milk of infected or affected with leukemia cows was fed to them. In the offspring of experimental animals pronounced signs of liver, kidney and myocardium damages were observed.

Key words: leukemia, cattle, rats яп outbred Wistar line, pathognomonic changes in organs, blood biochemical parameters.

Основная часть

Энзоотический бычий лейкоз (EBL) является инфекционным заболеванием, встречающимся в природе у крупного рогатого скота. Вирусная этиология этого лимфопролиферативного заболевания была впервые описана в 1969 г. J. Miller с соавт., которые обнаружили, что лимфоциты коров со стойким лим - фоцитозом продуцируют вирусные частицы, видимые в электронный микроскоп после культивирования in vitro [1]. Как только возбудитель EBL (BLV) заражает клетку, он интегрирует промежуточное звено ДНК в качестве провируса в определенные сайты генома клетки-хозяина либо случайным образом. Этот вирус преимущественно поражает В-клетки. У крупного рогатого скота поликлональная пролиферация характерна в основном для CD5+ IgM, продуцирующих В-клетки, которые и являются главной мишенью для провирусной интеграции BLV [2]. Однако и другие типы клеток, такие как CD4+ T-клетки, CD8+ T-клетки, у/5 T-клетки, моноциты и гранулоциты, также могут быть инфицированы BLV [3].

BLV-инфекция широко распространена во всем мире и, согласно данным Всемирной организации по охране здоровья животных (OIE), является болезнью, имеющей важное значение для международной торговли [4].

Хотя крупный рогатый скот является приоритетным природным хозяином BLV, буйволы, зебу, яки и альпака также могут быть инфицированы естественным путем. Экспериментальная BLV-инфекция была изучена у коз и овец, а также воспроизведена у кроликов, крыс и цыплят [5], что свидетельствует о значительном патогенном потенциале вируса.

М.И. Гулюкиным с соавт. были представлены доказательства возможности заражения кроликов вирусом лейкоза крупного рогатого скота, как перорально с молоком, так и парентерально кровью от больной энзоотическим лейкозом коровы, при этом у 30% зараженных животных был отмечен лейкозитоз до 11-12,6 тыс/мкл и относительный лимфоцитоз до 65-77%. ДНК провируса лейкоза в крови кроликов при пероральном способе введения была зарегистрирована уже через 7 сут от начала эксперимента, что на неделю раньше, чем при внутривенном введении крови, и является показателем эффективного проникновения вируса через барьер желудочно-кишечного тракта [6]. Значимая роль алиментарного пути заражения при лейкозе крупного рогатого скота показана и зарубежными авторами [5]. Анализируя данные М.И. Гулюкина с соавт. [6], можно заметить цикличность лейкозного процесса у кроликов, выражающуюся волнообразной динамикой результатов ПЦР и ИФА-исследований животных. Подобная волнообразная, но в общем виде аритмическая динамика была отмечена П.Н. Смирновым в гематологических показателях больных лейкозом коров, что автор связывает с реверсией продукции противовирусных антител - IgG на IgM и вновь на IgG [7].

Зарубежными исследователями было показано, что инокуляция кроликов и крыс BLV - продуцирующими клетками линии FLK-BLV (эмбриональные клетки почки ягненка) и лейкоцитами больной лейкозом коровы вызывает у 1/3 лабораторных животных первичное заболевание с клиническими (ринит и пневмония), гематологическими (лейкоцитоз с появлением незрелых клеток крови) и гистопатологическими (увеличение лимфатических узлов и лимфоцитарные инфильтраты) изменениями. Эти результаты, более выраженные у крыс, были аналогичны изменениям, индуцируемым полевым штаммом BLV у его природных хозяев [8].

В то же время V. Altanerova с соавт. сообщают, что у крыс линии Wistar при подкожном или внутри - брюшинном заражении клоном BLV-FLK клеток патогенные эффекты не были отмечены. Однако уже через 3 недели после инфекции была выявлена сероконверсия, наблюдавшаяся в течение всей жизни инфицированных крыс. Из селезенки этих крыс были получены 9 клеточных культур, одна из которых стойко продуцировала BLV, что, по мнению авторов, служит доказательством туморогенности BLV для крыс, и эти клетки были названы R (BLV). Показав персистирующую BLV-инфекцию у крыс, авторы предполагают, что крысы могут служить резервуаром вируса лейкоза крупного рогатого скота в природе [9].

K Boris-Lawrie с соавт. также сообщают, что BLV при подкожной инъекции клеток, продуцирующих вирус D17, и провирусной ДНК не приводит к клиническому заболеванию крыс, но при этом индуцирует продукцию антител к p24Gag и gp51Env антигенам вируса. Авторы считают, что индукция антител является свидетельством экспрессии вирусных генов, т.е. продуктивной BLV-инфекции у крыс [10].

В этой связи целью наших исследований стал поиск биохимических маркеров нарушения деятельности внутренних органов и гомеостаза организма в целом у BLV-инфицированных крыс линии Wistar, а также патогномоничных для лейкоза изменений.

Объектом исследования явились крысы линии Wistar (n=60). Крысы были разделены на 3 равные группы, содержались в идентичных условиях и ежедневно получали вволю свежее сырое коровье молоко. Первой группе (I) крыс скармливали молоко интактных коров, второй (II) - молоко BLV-инфицированных коров и третьей (III) - молоко клинически больных лейкозом коров (на основании данных госветслужбы). Потомство крыс содержалось совместно с родителями. Крысы всех групп были разделены на 2 подгруппы: в подгруппе «а» были взрослые крысы, в подгруппу «б» вошло их потомство.

Через 3, 6, 9 и 12 месяцев от начала эксперимента у животных каждой группы осуществляли аспирацию крови из боковой хвостовой вены для молекулярно-генетических (ПЦР), серологических (ИФА) и гематологических исследований. Биохимические исследования выполняли на анализаторе StatFax 3300 с применением реагентов производства АО «ДИАКОН-ДС» (Россия).

После получения крови по 5 крыс каждой группы подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков после предварительной аэрозольной анестезии диэтиловым эфиром. При вскрытии фиксировали патоморфологические изменения.

Цитологические изменения в селезенке детектировали путем световой иммерсионной микроскопии мазков-отпечатков (х1600), окрашенных с использованием набора Лейкодиф 200 (ЕгЬа Lachema, Чехия). Микроскопию осуществляли с помощью бинокулярного микроскопа Армед XS-90 (Россия).

Все исследования с участием крыс проводились согласно Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей.

Результаты ПЦР и ИФА-исследований животных показали, что уже через 3 месяца выкармливания молоком инфицированных и больных лейкозом коров крысы были инфицированы BLV. Крысы контрольных групп 1а и 1б были интактны к BLV на протяжении всего эксперимента [11].

Данные сравнительного анализа результатов биохимических исследований крови крыс приведены в табл. 1-4. При анализе результатов мы ориентировались как на референсные значения для крыс линии Wistar, приведенные в справочнике по физиологическим, биохимическим и биометрическим показателям нормы экспериментальных животных В.Г. Макарова и М.Н. Макаровой [12], так и на данные контрольных групп. При выборе биохимических маркеров крови мы руководствовались стандартным набором показателей, позволяющим охарактеризовать функциональное состояние основных органов и систем организма.

Таблица 1. Биохимические показатели крови крыс (3 месяца с начала эксперимента)

Примечание. Здесь и далее: * отличие опытной группы от контрольной; # отличие опытных групп между собой; Р<0,1.

Как следует из данных, представленных в табл. 1, в группе IIIa наблюдается увеличение содержание креатинина, что может свидетельствовать о развивающейся почечной патологии. В группе IIb повышение общего белка происходит за счет глобулиновой фракции, что свидетельствует о высоком иммунном статусе животных. В группах IIa и IIIa коэффициент де Ритиса составляет 4 и 3 соответственно, что может быть показателем сердечной патологии у животных.

Таблица 2. Биохимические показатели крови крыс (6 месяцев с начала эксперимента)

Спустя полгода с начала эксперимента изменения в биохимических показателях крови крыс относительно контроля становятся более выраженными (см. табл. 2). В группе 11а наблюдается значительное снижение показателя щелочной фосфатазы, что может свидетельствовать о нарушении в работе щитовидной железы у взрослых животных, в первую очередь, о ее гиперфункции. В группах Ша и Шб возрастает доля глобулиновой фракции белка, что может быть следствием прогрессирования инфекционного процесса. Коэффициент де Ритиса в экспериментальных группах продолжает расти, т.е. сердечная патология развивается. Повышение билирубина, так же как и увеличение активности печеночного фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в группе ПШ, может быть маркером начинающейся патологии печени либо гемолитической анемии в экспериментальных группах. Высокий уровень щелочной фосфатазы на фоне увеличения количества билирубина и предельных значений АЛТ в группе 11Ь, так же как и у потомства III группы, может являться маркером заболеваний гепатобилиарной системы. Увеличение содержания креатинина в сыворотке крови крысят 11б и 111б групп может быть признаком начинающейся почечной недостаточности, так как повышение концентрации креатинина при почечной недостаточности происходит раньше, чем повышение концентрации мочевины.

Таблица 3. Биохимические показатели крови крыс (9 месяцев с начала эксперимента)