9 группа - алкалоиды, производные хиназолина. К ним относится алкалоид пеганин (гармала обыкновенная).
10 группа - алкалоиды, производные пурина. К ним относятся кофеин из листьев чая, семян кофе, теобромин из семян шоколадного дерева.
11 группа - дитерпеновые алкалоиды. К ним относятся алкалоиды аконитов и живокостей.
12 группа - стероидные алкалоиды. К ним относятся алкалоиды чемерицы, паслена дольчатого.
13 группа - алкалоиды неустановленного строения.
На основании этой классификации классифицируется и сырье, содержащее алкалоиды.
Наиболее широко алкалоиды распространены в высших растениях: по имеющимся оценкам, от 10 до 25% видов высших растений содержат алкалоиды. Особенно богаты алкалоидами растения семейств маковые (Papaveraceae), пасленовые (Solanaceae), бобовые (Fabaceae), кутровые (Аросуnасеае), мареновые (Rubiaceae), лютиковые (Ranunculaceae), логаниевые (Loganiaceae). В растениях алкалоиды находятся в виде солей органических и неорганических кислот (лимонной, щавелевой, яблочной, уксусной, фосфорной и т.д.), растворенных в клеточном соке.
Обычно содержание алкалоидов в растениях невелико и составляет 0,01-0,1%. Если в растении накапливается 1-3% алкалоидов, сырье считается высокоалкалоидным.
1.3 Характеристика алкалоидов, содержащихся в сырье барвинка малого
1.3.1 Химическое строение и физико-химические свойства веществ
В барвинке малом содержатся алкалоиды - производные индола.
Индол (рис. 2) -- гетероциклическое конденсированное ароматическое соединение. Индольное ядро входит в химическую структуру алкалоидов барвинка малого травы.
Рисунок 2. Индольный цикл
Винкамин (лат. Vincaminum) -- монотерпеноидный индольный алкалоид (рис. 3), содержащийся в траве барвинка малого, на его долю приходится 25--65% от всех индольных алкалоидов этого растения.
Рисунок 3. Строение винкамина
Химическое название - метил-(3-альфа,14-бета,16-альфа)-14,15-дигидро-14-гидроксиэбурнамин-14-карбоксилат.
Буровато-коричневый порошок со специфическим запахом. Мало растворим в воде, разведенной уксусной кислоте и 0,1 н. растворе соляной кислоты с образованием слегка опалесцирующих растворов. Мало растворим в этаноле, практически нерастворим в хлороформе и эфире.
Акуамицин (рис. 4) - алкалоид барвинка малого. Агонист опиоидных рецепторов OPRM1, также имеется предположение о наличии антагонизма по отношению к глутаматным NMDA-рецепторам нейронов и глициновым рецепторам. Является сопутствующим веществом, усиливает вазодилатирующее и седативное действие винкамина.
Томбозин (рис. 5) - алкалоид барвинка малого. Эффективность на людях в настоящее время пока не доказана, но данный алкалоид оказывает седативный эффект на мышей и используется в ветеринарии для снижения кровяного давления животных, так что есть основания полагать, что он также способствует усилению фармакологического эффекта винкамина. [7]
Рисунок 4. Строение акуамицина
Рисунок 5. Строение томбозина
Винбурнин (рис. 6) - алкалоид рода растений Vinca и активный метаболит винкамина. Обладает вазодилатирующими свойствами. [8]
Рисунок 6. Строение винбурнина
Винкаминол (рис. 7) - алкалоид рода растений Vinca. Не представляет большого значения для медицинского применения сам по себе, но может быть использован для полусинтетического получения винкамина.
Рисунок 7. Строение винкаминола
Аймалицин (рис. 8) - алкалоид, обнаруживаемый в барвинке малом. Стимулирует циркуляцию крови, антиагрегант, также проявляет антиадренергические свойства по отношению к альфа-1-адренорецепторам. Слабый мышечный релаксант, оказывает умеренный седативный эффект.
Рисунок 8. Строение аймалицина
1.3.2 Способы выделения и очистки алкалоидов барвинка малого травы
Извлечение алкалоидов проводят из предварительного высушенного и измельченного растительного сырья. Алкалоиды могут быть извлечены в виде свободных оснований и в виде солей.
Сухое сырье для экстрагирования получают высушиванием стеблей с листьями и цветками барвинка малого при 40°С и измельчением до размера частиц не более 1 мм. Влажность сухого сырья не должна превышать 9%.
Сырье трехкратно в течение 24 ч экстрагируют водными растворами этанола, уксусной или соляной кислот при комнатной температуре. Полученные экстракты объединяют, концентрируют, разбавляют дистиллированной водой, при необходимости подкисляют 3% HCl и трижды очищают экстракт гексаном.
Гексановую фракцию отбрасывают, а водный экстракт охлаждают до 10 °С, доводят значение pH до 10 раствором аммиака и трижды экстрагируют алкалоиды хлороформом.
Наибольший выход алкалоидов (0,52-0,58% в пересчете на сухую массу) из травы отмечен при экстракции водными растворами этилового спирта. Увеличение концентрации этанола сопровождается ростом содержания алкалоидов в экстрактах. На рисунке 9 показана разница между выходом алкалоидов при использовании различных экстрагентов (этанол, HCl, уксусная кислота).
Рисунок 9. Выход суммы алкалоидов травы барвинка малого при экстракции водными растворами этанола, соляной и уксусной кислот.
Для выделения аймалицина в качестве экстрагентов можно использовать водные растворы этанола и уксусной кислоты. Как видно из полученных результатов (рис. 10), выход аймалицина в этанольных экстрактах -- 150-170 нг/г, в уксуснокислых -- 150-200 нг/г. Содержание аймалицина в экстрактах при использовании в качестве экстрагента соляной кислоты оказывается ниже предела определения.
Рисунок 10. Содержание аймалицина в экстрактах травы барвинка малого при различных способах экстракции.
Таким образом, наибольший выход фармакологически ценных индольных алкалоидов барвинка (винкамина и аймалицина) имеет место при экстракции водными растворами этилового спирта и уксусной кислоты.
1.3.3 Методы качественного и количественного анализа сырья
Все индольные алкалоиды дают осадочные реакции с общеалкалоидными реактивами, такими как реактив Майера, реактив Марме, 1% растворы фосфорномолибденовой, фосфорновольфрамовой, кремневольфрамовой кислот. [14]
Еще более быстрый и простой метод качественного анализа основан на способности ряда алкалоидов флуоресцировать в ультрафиолетовом свете. Для того чтобы обнаружить алкалоиды, достаточно нанести на фильтровальную бумагу каплю водной вытяжки или сока растения. Пятно светится при ультрафиолетовом облучении. Этот способ можно использовать как экспресс-метод, так как в этом случае выявить алкалоиды можно в течение нескольких секунд, что важно при массовых анализах в период заготовительных работ, когда необходимо отличать производящее растение от примесей. [13]
Для идентификации индольных алкалоидов часто используют 1% раствор пикриновой кислоты, дающей с алкалоидами стехиометрические кристаллические осадки, которые отфильтровывают, сушат и определяют температуру плавления. [14]
В качестве достаточно высокоспецифичной реакции на различные группы индольных алкалоидов используют так называемый тест Эрлиха - реакцию виннокислой соли алкалоида с раствором п-диметиламинобензальдегида в 65% серной кислоте. После воздействия света ртутной лампы или в присутствии следов хлорного железа развивается интенсивное окрашивание, варьирующее в зависимости от типа алкалоида от пурпурного до ярко-синего. Причиной окрашивания является образование хиноидного соединения типа розиндола. В качестве заменителя п-диметиламинобензальдегида можно использовать ванилин в концентрированной серной кислоте, при этом развивается красное окрашивание.
По реакции Гопкинса-Коуля с глиоксиловой кислотой в концентрированной серной кислоте кислотой развивается сине-фиолетовое окрашивание. [14]
Однако наиболее тонким и селективным методом анализа является бумажная или тонкослойная хроматография. Наиболее часто применяется система бутанол-уксусная кислота-вода в различных соотношениях. Хроматограммы проявляют реактивом Драгендорфа, дающего с алкалоидами оранжевые пятна, и сравнивают коэффициенты подвижности (Rf) опытных образцов и стандартных образцов веществ.
Для определения содержания суммы индольных алкалоидов барвинка малого, а также винкамина и аймалицина по отдельности, может использоваться метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.
Для первичной экстракции индольных алкалоидов из сухого сырья используются водные растворы этилового спирта и кислот с очисткой от сопутствующих соединений, последующим переводом экстрагированных алкалоидов в основное состояние, подщелачиванием экстракта и выделением алкалоидов органическим растворителем - хлороформом.
Полученные экстракты промывают водой, объединяют и упаривают. Осадок взвешивают для определения суммы индольных алкалоидов либо растворяют в метаноле и используют для ВЭЖХ-МС анализа.
Содержание винкамина и аймалицина в экстрактах определяют методом ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (МС/МС).
Растворы стандартов аймалицина (1 мг/мл) и винкамина (1 мг/мл) готовят путем растворения чистых веществ в метаноле.
Растворы для построения калибровочных кривых готовят в день эксперимента в диапазоне концентраций аймалицина и винкамина от 10 до 5000 нг/мл путем соответствующих разбавлений метанолом.
Разделение компонентов проб проводят на колонке ZorbaxExtend C18 при температуре +40°С с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1200.
Подвижная фаза состоит из двух растворителей: А - 8 мМ раствор ацетата аммония в деионизованной воде и В - 100% ацетонитрил.
С выхода хроматографа образец подается на вход тандемного масс-спектрометра Agilent 6410 TripleQuad (тройной квадруполь). В качестве интерфейса ионизации используется электроспрей в режиме генерации положительных ионов.
Для количественного анализа аймалицина и винкамина используют режим мониторинга заданных реакций (Multi Reaction Monitoring - MRM).
Следует отметить, что большая часть исследований индольных алкалоидов барвинка малого проводились в 50-70-х гг. прошлого века. В большинстве случаев для идентификации качественного состава исследуемых алкалоидов использовали тонкослойную и ионообменную хроматографии. Только в единичных работах, опубликованных в последние 20 лет, разделение и идентификацию алкалоидов барвинка малого проводили с использованием ВЭЖХ с УФ-детектированием [15-18]. В то же время применение современных методов позволяет, с одной стороны, более точно идентифицировать исследуемые соединения, с другой - проводить анализ и стандартизацию лекарственного растительного сырья на качественно новом уровне. Тандемная масс-спектрометрия в MRM-режиме предоставляет возможность проанализировать вещества на низких уровнях концентраций в многокомпонентных образцах растительных экстрактов. Предварительное разделение компонентов пробы на современной мелкозернистой хроматографической колонке, а также использование стандартов искомых веществ позволяют точно идентифицировать и количественно определять их содержание в экстрактах на фоне большого количества близкородственных соединений. Высокая чувствительность масс-спектрометрического детектирования по сравнению с УФ-детектированием дает возможность определить вещества в очень низких концентрациях, на уровне нг/мл.
На представленных хроматограммах (рис. 11) стандартов винкамина и одного из экстрактов хорошо видно, что использование детектирования в режиме MRM позволяет точно идентифицировать винкамин, несмотря на присутствие большого количества пиков, соответствующих, скорее всего, неидентифицированным близкородственным соединениям. Интересно также обнаружить в исследуемом экстракте аймалицин (рис. 11) - терпеновый индольный алкалоид с гипотензивной активностью.
Рисунок 11. Хроматограммы экстракта травы барвинка малого в сравнении с хроматограммами СО: А - содержание аймалицина в образце 22,2 нг/мл, в стандарте - 100,0 нг/мл, Б - содержание винкамина в образце 3,7 мкг/мл, в стандарте - 5 мкг/мл
Ранее аймалицин был идентифицирован только в растениях катарантуса розового и раувольфии змеиной [19]. Предполагается, что именно чувствительность используемого метода разделения и идентификации веществ позволяет идентифицировать этот алкалоид с крайне низким уровнем содержания.
1.4 Применение алкалоидов барвинка малого травы в официнальной и народной медицине
Винкамин -- сосудорасширяющее средство, увеличивает мозговой кровоток и утилизацию кислорода тканями мозга, снижает и стабилизирует сопротивление мозгового сосудистого русла. Тормозит адгезию и агрегацию тромбоцитов, вызывая уменьшение вязкости крови. Обладает гипотензивным, спазмолитическим и седативным действием. Повышает умственную работоспособность, улучшает память.
Применяется при начальных стадиях гипертонии, при нарушениях мозгового кровообращения в результате травмы либо вследствие инсульта, атеросклероза, спазма сосудов мозга, диабетической ангиопатии. Также применяется при мигрени, головокружениях, других вестибулярных нарушениях сосудистого происхождения.
Как общий стимулятор нервной деятельности применяется при рассеянности, нарушении речи, ухудшении памяти и снижении интеллектуальных способностей в пожилом возрасте; при замедленном развитии интеллектуальных способностей у детей и подростков.
В составе комплексной терапии может находить применение для коррекции нарушений концентрации внимания и координации движений при психических заболеваниях.
Усиливает эффекты антиагрегантов и гипотензивных средств.
Лекарственные формы включают сироп, капсулы пролонгированного действия, раствор для инъекций в ампулах.
Способ введения перорально, внутримышечно, внутривенно.
Торговые названия препаратов, в которых винкамин является действующим веществом: Оксибрал, Оксибрал СР, Виноксин МВ.