Дипломная (вкр): Генетические маркеры функционального долголетия крупного рогатого скота

Молекулярно-генетические маркеры нашли широкое применение в таких областях науки, как генетика, селекция, картирование хромосом, изучение механизмов эволюции, животноводстве и других [Хавкин, 1997].

К тому же использование молекулярно-генетических маркеров развило методы локализации и контроля локусов, определяющих качественные и количественные признаки [Xueyi, Ribaut, Gjnzalez-de-Leon, 1997].

Таким образом, на большом количестве типов полиморфизма ДНК построено постоянно пополняющееся огромное количество молекулярных маркеров для генетических исследований [Алтухов, Салменкова, 2002].

.2.1 Характеристика некоторых видов молекулярно-генетических маркеров

Однонуклеотидные замены или SNP (от английского Single Nucleotide Polymorphism). SNP точечные нуклеотидные замены (мутации) являются наиболее распространенным типом полиморфных маркеров и представляют собой замену одного нуклеотида на другой. Частота встречаемости - один на тысячу пар оснований, а их суммарное число в геноме коров достигает трех миллионов (по некоторым данным до десяти миллионов). Соотношение биаллельных и триаллельных однонуклеотидных замен сильно сдвинуто в сторону биаллельных, так как в процентах доля триалельных составляет одну десятую процента. Поэтому SNP маркеры обладают низким уровнем полиморфизма и высоким эволюционным консерватизмом.

Однонуклеотидные замены локализованные в кодирующих областях делятся на две категории:

синонимичные - не несут за собой замены аминокислотного состава в кодируемых белках

несинонимичные - изменяют аминокислотный состав кодируемых белков.

Однонуклеотидные замены могут изменять промоутерную активность, влиять на конформацию ДНК и пре-мРНК, определяя уровень транскрипции генов и эффективность сплайсинга.

Другим типом маркеров являются повторяющиеся последовательности, обладающие высокой степенью полиморфизма. Такие повторяющиеся последовательности могут быть подразделены на два класса: диспергированные повторы и тандемные повторы [Зиновьева, Эрнст, 2008]. К первым относятся такие мобильные элементы как рэтроэлементы SINE (short interspersed nuclear elements; 90-500 п.н.), LINE (long interspersed nuclear elements; до 7000 п.н.) и LTR (long terminal repeats) содержащие ретропозоны.

Тандемные повторы - это повторения определённых последовательностей в ориентации «голова к хвосту». Поскольку в них в одном локусе повторяется один и тот же мотив, эти последовательности получили названия сателлитов.

Тандемные повторы стали одними из самых высокоинформативных генетических маркеров у сельскохозяйственных животных, так как число тандемных повторов у различных животных в сателлитах сильно варьирует.

В зависимости от длины повторяющихся участков их подразделяют на несколько классов: максисателлиты, минисателлиты и микросателлиты [Georges, Massey, 1991].

Максисателлиты - общая длина повторяющихся последовательностей больше 5 п.н.

Минисателлиты - общая длина фрагментов составляет от нескольких тысяч до 30 тысяч п.н. При этом длина мотивов варьирует от десяти до шестидесяти п.н. [Jeffreys, 1985].

Микросателлиты - общая длина фрагмента, как правило, не превышает 350 п.н, а длина мотива составляет обычно от двух до шести п.н. [Tautz, 1989]. Микросателлиты находятся как в транскрибируемых, так и нетранскрибируемых участках ДНК.

С точки зрения информативности можно разделить полиморфные маркеры на биаллельные (однонуклеотидные замены) и мультиаллельные (тандемные повторы и диспергированные системы).

В нашем исследовании особое внимание уделено однонуклеотидным заменам, так как именно к ним относятся генетические маркеры долголетия крупного рогатого скота.

.3 Методы исследования SNP-маркеров. Полимеразная цепная реакция и полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

Метод полимеразной цепной реакции был разработан Кэри Мюллисом (фирма “Cetus”, США) в 1983 году [Mullis, Faloona, Scharf, 1986]. Данный метод позволяет добиться значительного увеличения концетрации малых фрагментов ДНК в биологическом материале (амплификация), а так же дает возможность вводить мутации, клонировать гены, сращивать фрагменты ДНК и так далее.

Сущность метода заключается в стандартном биологическом процессе, проходящем во всех клетках - репликация - комплементарное достраивание ДНК на матрице материнской ДНК при помощи специфического класса ферментов ДНК-зависимых ДНК-полимераз [Engelke, Krikos, Bruck, 1990].

Для реализации данного метода необходимы следующие компоненты:

ДНК-матрица (ДНК или её часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

праймеры (синтетические олигонуклеотиды, включающие 20-30 п.н., комплементарные последовательностям ДНК на границах определённого специфического фрагмента);

смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), т. е. смесь четырёх dNTP, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК;

фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из термофильных бактерий Thermis aquaticus, катализирующая удлинение цепей праймеров путём последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК);

буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы магния (Mg²⁺), необходимые для поддержания активности фермента);

ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой (рисунок 1). Каждый цикл амплификации включает три этапа, протекающих в различных температурных режимах:

Денатурация - нагревание двухцепочечной молекулы (при температуре 98). Приводит к расхождению цепей.

Отжиг - праймеры связываются с комплементарными участками на одноцепочечных молекулах ДНК.

Элонгация - работа Тaq-полимеразы, которая в течении этой стадии достраивает вторую цепь ДНК на одноцепочечной матрице используя праймер как стартовую площадку.

Рисунок 1 - Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Условно ПЦР метод можно разделить на два класса: амплификация с использованием неспецифических праймеров (RAPD-анализ или Random Amplified Polymorphic DNA) [Williams, Kubelic, Livak, 1990; Caetano-Anolles, Bassam, Gresshoff, 1991] и амплификация с использованием специфических маркеров.

ПЦР имеет ряд преимуществ. К ним относятся экономность в использовании ДНК, легкость в выполнении, автоматичность процесса, а также не требует радиоактивных меток для визуализации полиморфизмов [Кожухова, 1998].

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов. Мутации, возникающие в участках узнавания определённых рестриктаз, делают эти участки ДНК нечувствительными к действию ферментов. Обнаруживается это по изменению длины рестрикционных фрагментов [Никишина, 2007]. ПДРФ-анализ включает в себя следующие стадии:

выделение геномной ДНК;

рестрикция выделенной ДНК спецефической эндонуклеазой;

электрофоретическое разделение образовавшихся фрагментов;

идентификация этих фрагментов

На электрофореграмме при отсутстии рестрикции выявляют один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними участками рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном участке на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным участком рестрикции и одним из ближайших постоянных участков рестрикции.

Изучить состояние полиморфного локуса можно, проведя ПЦР и затем рестрикцию амплифицированного фрагмента. При обработки рестриктазой амплифицированного фрагмента его длина не изменится, если в исследуемой области ДНК отсутствует сайт узнавания. В том случае, когда участок узнавания не изменён, обработка рестриктазой создаст два фрагмента с общей длиной равной длине исходного фрагмента.

Таким образом, ПЦР-ПДРФ является наиболее удобным методом и дает хорошие результаты при изучении генетических маркеров функционального долголетия крупного рогатого скота.

.4 Генетические маркеры функционального долголетия крупного рогатого скота

Введение в линии животных желательных генотипов за счет особей, обладающих повышенным функциональным долголетием, является одним из главных подходов повышения функционального долголетия. Однако, функциональное долголетие относится к количественным признакам (QTL), т.е. его обуславливают целый комплекс генов, каждый из которых оказывает незначительный эффект на проявление признака. Вместе с тем, можно предположить, что лишь некоторые из них (главные гены) оказывают наибольшее влияние на проявление признака. Отсюда вытекает, что поиск и последующее использование предпочтительных аллелей главных генов приобретает большое значение в селекции [Зиновьева, 2008]. В данном случае в селекции коров с наибольшим продуктивным долголетием.

Поиском главных генов функционального долголетия занимаются многие исследователи. Однако наибольших успехов добилась группа польских ученых возглавляемая Д. Сцида [Evaluating markers … , 2011]. Ими были взяты образцы у 567 польских коров голштинской породы, для которых были идентифицированы генотипы с девятью однонуклеотидными полиморфизмами, локализованными в пяти генах:

бутирофилин (butyrophilin) подсемейство 1, член (BTN1A1, база данных GeneBank - GeneID: 282157), расположенный на BTA23: P35Q [Seyfert, Lüthen, 1998] и K468R [Taylor, Everest, Smith, 1996];

- ацил-КоА: диацилглицерин ацилтрансфераза, 1 ген (DGAT1, база данных GeneBank - GeneID: 282609) на BTA14: K232A;

ген рецептора лептина (LEPR, база данных GeneBank - GeneID: 497205) на BTA3: T945M [A missense mutation …, 2004];

ген лептина (LEP, база данных GeneBank - GeneID: 280836) на BTA4: Y7F [A new mutation …, 2003], R25C и A80V [Konfortov, Licence, Miller, 1999], а также замена С/Т в позиции 963 [Leptin promoter …, 2005];

АТФ-связывающий транспортер, подсемейство G, член 2 (ABCG2, база данных GeneBank - GeneID: 536203) на BTA6: Y581S [Identification of…, 2005].

Также было выяснено влияние этих генов на молочные характеристики коров: DGAT1 и ABCG2 существенно влияют на молочные характеристики, LEP и LEPR дают противоречивые результаты, а об эффекте BTN1A1 не сообщается.

Распределение генотипов среди коров приведено в таблице 2.

Таблица 2 - Количество коров, приходящееся на каждый класс генотипа

Генотипы были определены с помощью метода ПЦР - ПДРФ. Генотипы BTN1A1, DGAT1, LEP, LEPR определены Д. Сцида и И. Комисарек. Генотип ABCG2 определен И. Комисарек и А. Зарнецки.

Результатами их исследований стали данные, свидетельствующие о том, что полиморфизмом с самым высокой степенью влияния на функциональное долголетие крупного рогатого скота является LEP-R25C, расположенный внутри гена лептина. Для него относительный риск выбраковки животных с генотипом СС в 3,14 раз выше, чем для гетерозиготных животных.

Помимо LEP-R25C, также у FF гомозигот по полиморфизму LEP-Y7F риск выбраковки в 3,64 раза больше, чем у YY гомозигот. Риск выбраковки VV гомозигот в LEP-A80V в 1,83 раза больше чем АА гомозигот. Различия рисков между другими генотипами полиморфизмов в пределах других генов гораздо меньше (рисунок 2).

Рисунок 2 - Различия рисков выбраковки между генотипами полиморфизмов в пределах исследуемых генов

Эти результаты указывают на связь LEP с функциональной долговечностью и хорошо подтверждаются другими исследованиями в области здоровья пищевого поведения и воспроизводства молочного скота, которые также определяют функциональное долголетие. Ввиду растущей важности функциональных признаков молочного скота, LEP полиморфизмы следует рассматривать в качестве маркеров, определяющих решение в пользу того или иного выбора при селекции крупного рогатого скота.

Также была зарегистрирована корреляция гена лептина и его белка с долголетием у людей. Отмечено, что лептин способен снижать уровень висцерального жира, глюкозы в крови, инсулина и одновременно повышать уровень грилина ( «гормон голода» ).

На основе этих данных, можно с уверенностью сказать, что крупный рогатый скот является хорошей примером для изучения долголетия у людей.

.4.1 Характеристика гена лептина

У крупного рогатого скота ген лептина расположен в четвертой хромосоме. Он состоит из трех экзонов и двух интронов. Только два экзона кодируют последовательность аминокислот лептина. Кодирующая область гена лептина (ее длина составляет 501 п.н.) входит в состав второго и третьего экзонов, которые разделены интроном с длиной примерно 2 тыс. п.н. Область промоутера охватывает около 3 тыс. п.н. [Sharifzadeh, Doosti, 2012].

Интересующие однонуклеотидные полиморфизмы расположены в разных зонах гена лептина. Их местоположение приведено в таблице 3 [Komisarek, 2012].

Таблица 3 - Описание отдельных полиморфизмов гена LEP, приведенных в этом исследовании

Ген лептина - высокополиморфный ген. В нем, помимо интересующих нас SNP-полиморфизмов, расположены еще около шестидесяти однонуклеотидных замен. Причем, большинство из них расположено в интронных областях, что снижает их влияние на конформацию, аминокислотный состав и функцию белка лептина. Однако, рассматриваемы нами SNP-полиморфизмы расположены в кодирующих областях гена.

Рисунок 3 - SNP-полиморфизмы и структура гена лептина

Было установлено, полиморфизм R25C помимо влияния на функциональное долголетие также влияет на содержание жира и белка в молоке, на легкость отелов и гестацию [All Association of bovine…, 2010].

Была показана связь между полиморфизмом A80V и функциональным долголетием и рентабельностью животных [Szyda, Komisarek, 2007].

Таким образом, для исследования SNP полиморфизмов гена лептина методом ПЦР-ПДРФ необходимо знать его структуру (LEP состоит из трех экзонов и двух интронов), а также место локализации полиморфизмов (промоутер, второй и третий экзоны).

.4.2 Структура белка лептина и его физиологические функции у крупного рогатого скота