Дипломная (вкр): Генетические маркеры функционального долголетия крупного рогатого скота

Лептин является глобулярным белком, синтезируемым жировой тканью. Молекула лептина (16 кДа) состоит из 167 аминокислот с N-концевой секреторной сигнальной последовательностью из 21 аминокислот [Leptin, the obese…, 1996]. Относится к цитокинам - сигнальным белкам. Молекула лептина имеет четыре спиральные цепи с пятью - шестью полными оборотами. Основная физиологическая роль лептина проявляется снижением синтеза макроэргов и повышением затрат энергии [Agarwal, Rout, Singh, 2009]. Его механизм действия заключается в передаче в гипоталамус <#"868258.files/image006.gif"> 40 минут. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин. Переносим супернатант в чистую пробирку.

К 100 мкл крови добавляем 400 мкл лизирующего раствора (Lysisreagent). Приступаем к выделению без термостатирования.

. В пробирку с лизатом добавляем 20 мкл суспензии сорбента (диатомовые водоросли). Перед этим сорбент встряхиваем на вортексе. Ротируем 10 мин.

. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

. Осторожно, не задевая осадка, удаляем супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку прибавляем 200 мкл лизирующего раствора.

. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

. Удаляем супернатант. К осадку добавляем 1 мл рабочего однократного раствора солевого буфера (десятикратный солевой буфер (1М хлорид натрия (NaCl) и 1M хлорид калия (KCl)) разводим водой до 100 мл, а затем 96 % этиловым спиртом до 300 мл и перемешиваем).

. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

. Удаляем супернатант, к осадку добавляем 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешиваем, центрифугируем десять секунд при 5000 об.

. Удаляем супернатант. Убираем полосками фильтровальной бумаги остатки жидкости над сорбентом, меняя полоски от пробы к пробе.

. Осадок сушим в термостате при температуре 65 пять минут.

. К осадку добавляем 100 мкл ЭкстраГена (10 прцентная смесь ионообменников (типа Chelex), и 0,01процентный тритон X-100). Пробирку с ЭкстраГеном хорошо перемешать. Ресуспендируем на вортексе и термостатируем пять минут при температуре 65 .

. Центрифугируем при 12000 об/мин

. Перенести содержащую ДНК надосадочную жидкость (80 мкл) в чистую пробирку.

Выход ДНК составлял 3-5 мгк/100 мкл с OD 260/280 от 1,6 до 2,0.

.3 Анализ полиморфизмов гена LEP методом ПЦР/ПДРФ

.3.1 Амплификация фрагментов гена LEP методом ПЦР

Полиморфизмы гена лептина (LEP) определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) по методике Л.А. Клашниковой, Н.А. Зиновьевой, используя соответствующие праймеры.

Амплификация проводилась набором реагентов для ПЦР амплификации ДНК произведенным фирмой НПО "СибЭнзим", г. Новосибирск.

Для амплификации участков гена использовались следующие последовательности праймеров:

для участка R25C гена LEP::CCAGGGAGTGCCTTTCATTA:GGTGTCATCCTGGACCTTCC

для участка A80V гена LEP::CAAGCAGGAAATAGGGAGTCATGG:CTGGTGAGGATCTGTTGGTAGGTC

для участка Y7F гена LEP::CTGCGTGGTCTACAGCACACCTC:AGGGCCAAAGCCACAGGATTCG

ПЦР проводили с 3 мкл ДНК в конечном объеме 25 мкл. Состав реакционной смеси приведен в таблице 4. Состав ПЦР-буфера:буфер для ДНК полимеразы Taq, (60 мМ Трис-HCl (pH 8.5 при 25°C); 1.5 мМ хлорида магния (MgCl2); 25 мM хлорида калия (KCl); 10 мM 2-меркаптоэтанол; 0.1 прцентный Тритон X-100.)

В пробирки с реакционной смесью добавляли минеральное масло (НПФ «Литех») для предотвращения испарения жидкости и помещали в амплификатор «Терцик МС-2», разработанный ОАО «ДНК-Технология» (Москва) для проведения ПЦР. В каждом из режимов ПЦР для амплификации фрагментов гена лептина в первом цикле денатурация была удлинена до трех минут, последний цикл проходил при температуре 72  в течение трех минут сорока секунд для полной достройки матрично-праймерных комплексов.

Таблица 4 - Состав реакционной смеси для амплификации фрагментов LEP, содержащих полиморфизмы R25C, Y7F и A80V

Учитывая особенности амплифицируемых участков, а также технические характеристики амплификатора, нами были подобраны различные режимы амплификаци для трех полиморфизмов. Режим амплификации для участка, содержащего полиморфизм A80V, представлен в таблице 5.

Таблица 5 - Режимы амплификации участка с полиморфизмом A80V

Для амплификации фрагментов гена LEP, содержащих полиморфизмы R25C и Y7F был выбран режим, представленный в таблице 6.

Таблица 6 - Режим амплификации участков гена LEP с полиморфизмами R25C и Y7F

В результате полимеразной цепной реакции получаются ПЦР-продукты с размерами: 305 п.н. для R25C; 424 п.н. для A80V; 310 п.н. для Y7F.

Для контроля прохождения реакции и оценки качества и концентрации проводили электрофорез в 1.5% агарозном геле (таблица 8).

.3.2 Рестрикционный анализ

Для проведения рестрикционного анализа фрагментов второго и третьего экзонов по полиморфизмам R25C, A80V и Y7F использовались соответсвующие эндонуклеазы рестрикции фирмы НПО «СибЭнзим», г. Новосибирск: Bsp 13 I, PspEI и Bpu 14 I, соответственно (таблица 7).

Таблица 7 - Характеристики эндонуклеаз рестрикции, использованных в работе

Состав буфера для инкубации SE 2K (НПО «СибЭнзим», г. Новосибирск): 10 мМ Трис-НСl (pH 7.6 при С); 10 мМ хлористого магния (Мg; 200 мМ хлорида калия (КCl); 1 мМ DTT.

Состав буфера для инкубации SE B (НПО «СибЭнзим», г. Новосибирск):

мМ Трис-НСl (pH 7.6 при С); 10 мМ хлористого магния; 1 мМ DTT.

Состав буфера для инкубации SE G (НПО «СибЭнзим», г. Новосибирск): 10 мМ Трис-НСl (pH 7.6 при С); 10 мМ хлористого магния (Мg; 50 мМ хлорида натрия (NaCl); 1 мМ DTT.

Рестрикцию проводили в 20 мкл инкубационной смеси (15 мкл реакционной смеси и 5 мкл амплификата). К смеси рестрикции по полиморфизму R25C добавили минеральное масло (НПФ «Литех») для предотвращения испарения жидкости при инкубации в термостате.

Рестрикцию по полиморфизму R25C термостатировали при температуре 50  в течение 3-х часов. Рестрикции по полиморфизмам Y7F и A80V термостатировали при температуре 37 в течение 3-х часов.

После рестрикции амплификата гена LEP эндонуклеазой Bsp 13 I по полиморфному участку R25C гомозиготные животные по аллелю R (генотип RR) образуют один фрагмент величиной 305 п.н., гетерозиготные RC - три фрагмента: 305, 283, 22 п.н., а несущие генотип СС - два фрагмента: 283, 22 п.н.

После рестрикции амплификата гена LEP эндонуклеазой PspEI по полиморфизму A80V гомозиготные животные по аллею А образуют один фрагмент - 424 п.н, гетерозиготные AV - три фрагмента: 424, 398 и 26 п.н., гомозиготные по аллелю VV - два фрагмента: 398 и 26 п.н.

Рестрикция амплификата гена LEP эндонуклеазой Bpu 14 I по полиморфизму Y7F показала, что гомозиготные животные по аллелю Y образуют один фрагмент длиной 310 п.н., гетерозиготные YF - три фрагмента: 310, 288 и 22 п.н, гомозиготные по аллелю FF - два фрагмента: 288 и 22 п.н.

.4 Электрофорез

генетический маркер скот лептин

Молекулярный вес продуктов ПЦР и их фрагментов, полученных после рестрикции, определяли с помощью горизонтального электрофореза в агаразном 1,5 - 2,5 % геле (таблица 8) с использованием пятикратного трис-боратного буфера (TBE имеет состав: 54 г Трис-НСl; 27,5 г борная кислота; 2 мл 0,5 M ЭДТА, рН 8,0 доводят дистиллированной водой до 1 литра) [Уильямс, Уилсон, 1978].

После смешивания компонентов гель нагревают до кипения и оставляют в термостате на два часа при температуре 50 , чтобы молекулы полисахарида сформировали однородную решетку геля.

Образцы ДНК смешивали с буфером для нанесения проб, содержащим 50 процентов глицерина, 50 % TBE-буфера и 0,025 % бромфенолового синего. Смешанные пробы вносили в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез обычно вели при постоянном напряжении 100 V [Мазин, Краев, Потапов, 1990]

Таблица 8 - Приготовление 1.5% и 2% агарозного геля

Гель после электрофореза высушивали и просматривали в ультрафиолетовых лучах, при этом краситель, интеркалирующий в молекулу ДНК, испускал волны в красно-оранжевой области видимого спектра 590 нм. После визуального осмотра гель фотографировали в ультрафиолетовых лучах.

На рисунке 4 представлена электрофореграмма рестрикции амплификата гена LEP по полиморфизму R25C.

Рисунок 4 - Электрофореграмма продуктов рестрикции участка гена LEP по полиморфизму R25C

На шестой дорожке находится маркер молекулярных весов с шагом в 50 п.н. Животное с генотипом CC находится на четвертой дорожке; гомозиготные животные по аллелю R представлены на третьей и пятой дорожках. Генотип RC - на первой и второй и с седьмой по десятую.

На рисунке 5 представлена электрофореграмма рестрикции участка гена LEP по полиморфизму A80V.

Рисунок 5 - Электрофореграмма рестрикции гена LEP по полиморфизму A80V

Рисунок 6 - Электрофореграмма рестрикции участка гена LEP-Y7F

На пятой дорожке находится маркер молекулярных весов. Гомозиготные по аллелю АА животные показаны на второй, четвертой, седьмой, восьмой и десятой дорожках, а гетерозиготные (AV) на первой, третьей, шестой, девятой, одиннадцатой и тринадцатой дорожках. Гомозиготы VV на данном снимке отсутствуют.

На рисунке 6 изображена электрофореграмма рестрикции участка гена LEP по полиморфизму Y7F.

На четвертой дорожке находится маркер молекулярных весов. На пятой - минус-контроль. На восьмой дорожке представлена гетерозиготное животное (YF). На остальных - гомозиготные животные (YY). Гомозиготы по аллелю FF на данном снимке не представлены.

.5 Статистическая обработка данных

Биометрическая обработка полученных материалов проводилась статистическими методами. Определение достоверности разницы между исследуемыми значениями проводились с помощью критерия  и критерия Стьюдента при 5% и 1% уровне значимости на персональном компьютере при помощи пакета программ «Microsoft Office 2010», где  - среднее арифметическое значение, ±m - стандартная ошибка среднего.

3. Использование полиморфизмов гена лептина в качестве генетических маркеров функционального долголетия в селекции крупного рогатого скота

В связи с растущими потребностями в продукции мясного и молочного скотоводства ДНК-технологии занимают все более важное место в ряду перспективных методик, используемых в животноводстве. К ним относится и маркер-зависимая селекция. Она использует ДНК-маркеры, которые непосредственно или опосредованно влияют на интересующие селекционеров хозяйственные полезные признаки.