роста несколько растягивается во времени и стабилизируется. У большинства изученных штаммов показатели темпов роста
вэтот период увеличиваются незначительно, по сравнению с контролем. Эффект синхронизации развития культуры на примере микромицетов – продуцентов антибиотиков отмечался нами ранее и описан в ряде работ (Ильина и др., 2000; Ильин и др., 2001). Возможно, в данном случае обнаруживается результат действия подобного механизма, то есть нивелируются факторы окислительного стресса, провоцирующие старение культуры. Использование соединений селена в практике хранения культур обеспечило сохранение последних в жизнеспособном состоянии в течение длительного периода, более стабильный, относительно контрольных показателей, антиоксидантный статус мицелия, что
всовокупности свидетельствуют о значительном нивелировании фактора окислительного стресса. Известно, что селен, как часть глутатионпероксидазы, оказывает защитное действие при окислительном стрессе, катализируя распад перекиси водорода или разложение гидроперекисей липидов и тем самым, прерывая переокислительную цепную реакцию свободных радикалов (Grossman and Wendel, 1983). Кроме того, в ряде литературных источников на соединения селена – селенаты – указывают как на антиметаболиты (Birkett and Rowlands, 1981). В данном случае имеет место стабилизация обменных процессов, на фоне которой замедление метаболических реакций влечет за собой торможение свободнорадикальных процессов. С фундаментальных позиций полученные результаты свидетельствуют в пользу общебиологической концепции роли селена в живых организмах. Такой способ хранения культур является авторской разработкой и запатентован (Патент№2185435, 2002).
Любые разработки в области биотехнологии предполагают
вкачестве обязательных этапов скрининг штаммов продуцентов того или иного продукта (биомассы или ценных метаболитов), а также периодическую верификацию самого продуцента. Открытие новых биологически активных веществ, продуцируемых высшими базидиальными грибами, в настоящий период идет нарастающими темпами. С этих позиций исследования, проводимые с целью разработки новых методов скрининга, становятся все более актуальными.
185
В ходе проведенных исследований предложен метод скрининга перспективных штаммов – продуцентов стеринов. Сродство эргостерина и некоторых ценных метаболитов стериновой природы и их производных (ганодеровые, ганодериковые кислоты и т.п.) свидетельствует о целесообразности подобных исследований. Метод основан на селекционном отборе штаммов, резистентных к воздействию полиенового макролида нистатина. Впервые установлены токсичные для базидиальных макромицетов концентрации названного полиена, установлены возможные пути адаптации к его действию у разных видов. Ряд этих адаптаций связан с интенсификацией синтеза эргостерина. Не исключено, что и в естественных условиях, аналогичный механизм (воздействие антибиотиков полиеновой природы, продуцируемых микроорганизмами, входящими в консорцию растениясубстрата), может выступать в качестве одного из факторов отбора штаммов ксилотрофных базидиомицетов, способных к реализации полного жизненного цикла (от базидиоспоры до базидиоспоры). Общебиологическое значение имеет показанная в работе связь динамики эргостерина в мицелии с протеканием морфогенетических процессов культур.
Особый интерес при проведении исследований представляло изучение роли и влияния на ход развития культуры со стороны компонентов природного субстрата дереворазрушающих грибов
– источников целлюлозы и лигнина. По мнению ряда авторов, лигнин, как компонент древесного субстрата, может влиять на морфогенез культуры в естественных условиях (Фенгел, 1988). Традиционно в практике грибоводства используются твердые органические лигноцеллюлозные субстраты, однако корригирующая и трофическая роль лигнина практически не исследована. Поскольку лигнин древесины на разных стадиях ее разложения характеризуется различной структурой, прежде всего, различной доступностью свободных метоксильных групп, в исследования были включены лигноцеллюлозные материалы с разной степенью конденсации молекулы лигнина и разным количеством доступных метоксильных групп. Выявлена связь между концентрацией метоксильных групп в субстрате и интенсивностью развития культур. Установлено, что активнее осваивают обогащенный метоксильными группами субстрат представители видов, чаще
186
встречающихся в природе на древесине высокой степени разложения, причем вне зависимости от типа вызываемой гнили. Вероятно, такие виды эволюционно адаптированы к эффективному использованию обилия метоксильных групп древесины, в значительной степени разрушенной. Путем обогащения метоксильными группами глубинных сред удалось повысить продукцию биомассы мицелия у большинства изученных видов грибов, возбудителей белой гнили древесины. Известные из литературы модельные опыты с различными метоксилированными фенолами показали, что грибы белой гнили деметилируют метоксильные группы (Maloney, 1978), а эксперименты с меченым (14С) лигнином свидетельствуют, что при разложении лигнина грибами белой гнили конечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец (Фенгел, Вегенер, 1988). Таким образом, достоверно показано: трофическая роль лигнина, включение метоксильных групп лигнина в метаболизм ксилотрофных базидиомицетов; а также целесообразность использования метоксилированных лигноцеллюлозных материалов в качестве компонентов питательных сред для дереворазрушающих базидиомицетов. В отношении корригирующей роли лигнина – обнаружена интенсификация процесса синтеза эргостерина культурами грибов белой гнили в присутствии в среде метоксилированного субстрата (экстракта лигнина). Установленная связь динамики этого метаболита в мицелии и морфогенеза культуры показала возможность стимуляции внесением лигноцеллюлозных, обогащенных метоксильными группами, материалов, процесса плодоношения у грибов указанной группы в условиях чистой культуры. Показаны возможности модификации разных сторон ферментативной активности мицелиальных культур путем обогащения среды такими компонентами.
С позиций биотехнологии важным и заслуживающим внимания моментом представляется обнаружение зависимостей между ростовыми характеристиками культуры и некоторыми сторонами ее ферментативной активности. Относительно быстрорастущие на агаризованных и твердофазных питательных субстратах штаммы грибов белой гнили, в среднем характеризуются более
187
высокой общей пероксидазной, а медленнорастущие – более выраженной общей оксидазной активностью. С фундаментальных позиций обнаруженные факты свидетельствуют о параллельном существовании различных эколого-биохимических стратегий, причем реализуемых на внутривидовом уровне. С практических же позиций, обнаруженные закономерности, с определенными долями вероятности, можно использовать при скрининге штаммов – перспективных продуцентов ферментов.
Верификация вида продуцента возможна в основном при наличии плодового тела. Использование в качестве компонентов питательного субстрата лигноцеллюлозных источников, обогащенных метоксильными группами, обеспечило возможность получения телеоморфы у изученных грибов белой гнили. О триггерной роли указанных компонентов лигнина в процессе морфогенеза базидиом свидетельствует тот факт, что примордии и зрелые базидиомы на стерильной среде у большинства видов удалось получить лишь при использовании метоксильных групп лигнина. На основе полученных данных разработана и запатентована лабораторно-промышленная технология получения типичных базидиом одного из наиболее перспективных в биотехнологии видов ксилотрофных базидиомицетов – Ganoderma lucidum (Патент №9773126, 2011). Технология позволяет одновременно решить целый ряд актуальных задач: биоконверсию отходов растениеводства и лесоперерабатывающей промышленности, получение плодовых тел G. lucidum – ценного фармацевтического сырья, а также получение массы отработанного вегетативного мицелия на гидролизованном органическом носителе, пригодного для приготовления на его основе кормовой добавки к рационам сельскохозяйственных животных. Разработанная добавка апробирована в условиях предприятия, освидетельствована актом комиссионного испытания и рекомендована к внедрению.
Таким образом, совокупность проведенных исследований позволила раскрыть некоторые перспективные стороны физиологического потенциала природных изолятов ксилотрофных базидиомицетов. Установленные факты и закономерности, полученные с использованием большого объема экспериментального материала, представляют интерес, как с теоретических, так и прикладных позиций.
188
ЛИТЕРАТУРА
1.Автономова, А.В. Оптимизация состава питательной среды для погружённого культивирования Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.)P. Karst / А.В.Автономова, Л.М.Краснопольская, В.Н. Максимов // Микробиология.–2006. – Т.75 – №2. – С. 186–192.
2.Автономова, А.В. Противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства гриба бессмертия Ganoderma lucidum / А.В Автономова, Л.М Краснопольская // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты.–М., 2007. 216–224 с.
3.Азаров, В.И. Химия древесины и синтетических полимеров/ В.И Азаров, А.В Буров, А.В Аболенская.–С.-Пб., 1999. 628 с.
4.Айзенштадт, М.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений / М.А Айзенштадт, К.Г Боголицын // Химия растительного сырья.–2009.–№2.–С.5–18.
5.Александрова, Г.П. Влияние состава питательной среды на лигниназную активность базидиомицета Phanerochaete crysosporium /Г.П Александрова, С.А Медведева, В.А Бабкин, В.А. Соловьёв, О.И Малышева, С.З Иванова // Химия древеси- ны.–1989.–№6.–С.77–80.
6.Александрова, Г.П. Биоотбелка сульфатной целлюлозы оксидазными ферментами гриба Daedaleopsis confragosa / Г.П Александрова, С.А Медведева.// Химия растительного сырья.– 1999.–№2.–С. 81–84.
7.Андреева, В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений/ В.А. Андреева.– М.,1988.–128 с.
8.Антоненко, Л.А. Отбор культур базидиальных грибов Coriolus zonatus (Trametes zonatus) на жидких питательных средах / Л.А.Антоненко, И.Р.Клечак, О.И Нишпорская // Иммунопатология, аллергология, инфектология.–2009.–№ 2–С. 159.
9.Ахмедова, З.Р. Биодеградация растительных отходов грибом Pleurotus ostreatus/ З.Р. Ахмедова // Биотехнология.-1992.-№ 3.-С.109–115.
189