Автореферат: Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания

1.6 Основные положения, выносимые на защиту

1. В поддержании гомеостаза организма позвоночных животных в ответ на действие зоотоксинов закономерно развиваются общие неспецифические иммунофизиологические реакции.

2. Иммунотропная активность зоотоксинов зависит не только от их химической природы, но и положения организма-продуцента в токсинологической классификации.

3. Гуморальные иммунные реакции стимулируются низкими и угнетаются высокими дозами ядов активно- и пассивно-ядовитых животных.

4. Белковые яды активно- и пассивно-ядовитых животных в низких дозах стимулируют клеточные иммунные реакции, тогда как яд небелковой природы невооруженных активно-ядовитых животных угнетает их.

5. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) клеток крови стимулируется белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо от их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.

6. Прогрессирующая лейкопения индикаторных видов амфибий является характерным показателем возрастания средового стресса, оцениваемого по величине флуктуирующей асимметрии.

7. Репрезентативным показателем усиления пресса антропогенной нагрузки на организм является возрастание доли агранулоцитов в периферической крови индикаторных видов амфибий.

1.7 Публикации

По материалам диссертации опубликовано 58 научных работ, в том числе 12 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и получен 1 патент.

1.8 Личный вклад соискателя

В основу диссертационной работы положены многолетние (1984-2008 гг.) исследования по изучению физиологических механизмов поддержания гомеостаза организма. Постановка проблемы, проведение экспериментальных исследований, обработка и оценка результатов, интерпретация полученных материалов и научные выводы диссертационной работы принадлежат автору.

Благодарности. Автор считает своим долгом выразить искреннюю сердечную благодарность и признательность своему научному консультанту д.б.н., профессору Д.Б. Гелашвили. Автор благодарен соавторам и сотрудникам клинико-диагностической лаборатории и лаборатории молекулярной иммунологии Института иммунологии МЗ РФ; лаборатории инженерной энзимологии Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН РФ (г. Москва); лаборатории молекулярной иммунологии бактериальных и вирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии и лаборатории биохимии НИЦ «Биофармавтоматика» (г. Нижний Новгород), где выполнялась часть работы. Автор выражает слова благодарности соавторам, коллегам, коллективу биологического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского за помощь и участие в выполнении работы. Автор благодарен д.м.н., профессору Н.А. Добротиной, д.б.н., профессору В.В. Новикову, д.б.н. профессору А.П. Веселову, к.б.н. Е.И. Исаевой за конструктивные замечания, советы и помощь.

2. Содержание работы

Введение

Включает обоснование актуальности темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна, научная и практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

2.1 Обзор литературы. Современные проблемы иммунофизиологических механизмов адаптации организма к стрессорным факторам среды»

В главе представлена сводка современных основных работ отечественных и зарубежных исследователей, посвященных характеристике структурно-функциональных блоков иммунной системы; даны представления о физико-химических свойствах и механизмах действия животных ядов, вырабатываемых продуцентами разных токсинологических групп; анализируются эпигенетический и иммунологический подходы для комплексной оценки стабильности развития живых организмов.

2.2 Материалы и методы

2.2.1 Характеристика материалов и объектов исследования

В работе были использованы выборки из природных популяций амфибий рода Rana и лабораторные животные - всего 2254 особи, яды животных (зоотоксины) разных систематических групп, донорская кровь и плазма (табл.1).

Природные животные яды (зоотоксины). Яды рептилий (Reptilia) (подотряд змей-Ophidia): гадюки обыкновенной - Vipera berus L., сем. Viperidae; гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной - Echis carinatus Schneid., сем. Viperidae; гадюки Никольского - Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva сем. Viperidae; кобры среднеазиатской - Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae, полученные из Института экологии Волжского бассейна РАН и НПФ «Биоком» (г.Тольятти). Яды амфибий (Amphibia): зеленой жабы - Bufo viridis Laur., сем. Bufonidae; яды паукообразных(Arachnida): кавказского скорпиона - Buthus caucasicus Nordm., сем. Buthidae; яды насекомых (Insecta): пчелы медоносной - Apis mellifera L., сем. Apidae; колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata Say., сем.Chrysomelidae, полученные в экспедициях сотрудниками кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ.

Таблица 1 Экспериментальные животные и биологические материалы, использованные в работе

Образцы ядов готовились непосредственно перед опытом и вводились в дозах кратных ЛД_50. ЛД₅₀ определяли для каждого образца яда на лабораторных животных методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963).

Антитела к зоотоксинам. Для получения иммунных сывороток белым лабораторным мышам (20 особей, массой 18-20 г, содержащихся на обычном рационе вивария), трехкратно подкожно вводили стерильный раствор яда гюрзы среднеазиатской (3,0 мкг/мышь) в течение 3 месяцев с интервалом в 3 недели. Иммунизацию мышей гемолимфой колорадского жука проводили двумя способами: однократно, внутрибрюшинно в дозах 0,5-5,5 мг/кг с забором крови (методом декапитации) на 7, 15 и 24 сутки первичного иммунного ответа и трехкратно, подкожно, по 3 мкг/мышь с интервалом в три недели. После окончания иммунизации, в полученных сыворотках, выявляли специфические антитела одним из вариантов твердофазного иммуноферментного анализа (ПАП-методом) (Новиков, Андреев, 1987). Сорбцию антигенов яда гюрзы (в концентрации 1,0 мг/мл, по 150 мкл в натрий фосфатном буфере, рН 7,3 0,1) проводили в лунках полистероловой планшеты с последующей инкубацией при +4⁰С в течение 24 ч. Для постановки сандвич-варианта иммуноферментного анализа (Коллинз, 1991) использовали коммерческий препарат моновалентной противозмеиной сыворотки «Антигюрза» (Ташкентский НИИ вакцин и сывороток), кроличьи антитела к иммуноглобулинам лошади и антикроличий конъюгат с пероксидазой хрена.

Липосомы. Из очищенного фосфатидилхолина (10% лецитин-стандарт) получали липосомы, в которые включали нативный яд Vipera lebetina (0,04 ЛД₅₀) двумя способами: методом обращения фаз (Szoka, Papahadjopoulos, 1978); либо диспергированием (Bangham, Standish, Watkins,1965). Формирование липосом и процент включения яда оценивали флуоресцентным методом, используя в качестве метки флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ, «Serva») и кальцеин («Serva»). Полноту удаления несвязанного ФИТЦ-меченного яда контролировали центрифугированием в градиенте плотности фиколла (ультрацентрифуга “Beckman”35 тыс.об./мин, 17⁰С, 1 ч). Из каждой пробирки отбирали по 10-11 фракций и определяли интенсивность флуоресценции до и после добавления детергента (Тритон Х-100) и, соответственно, процент связывания яда с фосфолипидными липосомами.

Аллерген из пчелиного яда. Аллерген приготовлен из нативного яда пчел медоносных - Apis mellifera L., стабилизированного сывороточным человеческим альбумином (0,03 мкг/мл) и лиофилизированного. В работе использовали четыре лабораторно-экспериментальные серии аллергена (1000 мкг белка яда). Сухой препарат растворяли в 1 мл разводящей альбуминовой жидкости, содержащей 0,3 % раствора альбумина человека в жидкости Эванса-Кока. Безвредность и острую токсичность проверяли на мышах (50 особей), массой 16-18 г. Хроническую токсичность, специфические иммуногенные свойства - на морских свинках, массой 200-250 г, содержащихся на обычном рационе вивария.

2.2.2 Методы исследования гуморальных иммунных реакций

Экспериментальная модель in vivo первичного иммунного ответа. Экспериментальной моделью первичного иммунного ответа на тимусзависимый антиген являлась иммунизация мышей линии СВА и (СВА х С57Bl) _F1 - гибридов 10% взвесью эритроцитов барана (ЭБ). На 5, 7 и 10 сутки иммунного ответа, в селезенке мышей определяли число антителообразующих клеток (АОК) методом локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965).

Антитела в сыворотке крови иммунизированных животных. Титр антител (до 30 суток иммунного ответа) в сыворотке крови мышей определяли реакцией гемагглютинации (Кэбот, Мейер, 1968). Результаты выражали через log₂Т, где Т - наибольшее разведение сыворотки, дающее положительную реакцию (++).

2.2.3 Методы исследования клеточных иммунных реакций

Экспериментальная модель гиперчувствительности замедленного типа. Для индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo применяли метод Tamura et al. (1983) с дополнениями (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). При воспроизведении реакции использовали разные антигены: тимусзависимый - эритроциты барана (Collins, Morrison, 1976) или растворимые белковые - яичный альбумин (ЯА), метилированный бычий сывороточный альбумин (МБСА, “Serva”, Германия) (Земсков и др., 1988). Для индукции реакции ГЗТ к белковому антигену применяли метод сенсибилизации животных МБСА (250 мкг/0,1 мл) с использованием в качестве адъюванта красителя синего Эванса (ЭС, “Serva”, Германия), для оценки супрессорного действия или без применения адъюванта - для оценки стимулирующего действия. Местную реакцию на введение разрешающей инъекции антигена (25 мкг) оценивали через 24ч по разнице массы опытной и контрольной конечностей каждой мыши. В опыты были включены группы мышей, которым делали только разрешающую инъекцию антигена (отрицательный контроль) и животные, получавшие как сенсибилизирующую, так и разрешающую инъекцию антигена (положительный контроль).

2.2.4 Методы оценки иммуногенных и анафилактогенных свойств зоотоксинов

Иммуногенные свойства. Оценку иммуногенных характеристик аллергена проводили методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) (Ovary, Benacerraf, Block, 1963). Для сенсибилизации использовали аллерген из яда пчел (по 0,1 мл в подушечки четырех лап). Сыворотку крови получали на 28-30 день внутрисердечным забором. Разведения сыворотки (1:2 - 1:1024) вводили интактным морским свинкам-альбиносам. Через 24 ч животные получали разрешающую инъекцию в объеме 0,2 мл на 100 г массы тела. Затем животных забивали и проводили учет реакции по внутренней стороне снятой шкурки.

Анафилактогенные свойства. Животным, на 30-40 день после сенсибилизации аллергеном из яда пчел, вводили разрешающую дозу пчелиного яда. Анафилактический индекс определяли по Вейглу (Weigle et al., 1960).

2.2.5 Методы оценки функциональной активности и состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ)

Фагоцитарная активность. Фагоцитирующую активность клеток крови изучали с помощью люминолзависимой хемилюминесценции (Добротина и др., 1991). Измерения проводили на биохемилюминометре БХЛ-06, производства НИЦ «Биоавтоматика» г. Нижний Новгород. В качестве наблюдаемых параметров использовали интенсивность и светосумму хемилюминесценции сигнала (в мВ).

Перекисное окисление липидов (ПОЛ). Оценку интенсивности процесса ПОЛ эритроцитов донорской крови проводили с помощью системы сульфат железо-перекись водорода (Владимиров, Арчаков, 1982). Змеиные яды использовали в концентрациях 50 и 100 мкг/мл; пчелиный яд в концентрации 1,0 и 2,5 мкг/мл.

2.2.6 Методы эпигенетического и иммунологического подходов для оценки состояния природных популяций

Стабильность развития. В качестве объекта был использованы фоновые виды зеленых лягушек рода Rana. Стабильность развития оценивали по интегральному показателю флуктуирующей асимметрии (Захаров, 1978; Захаров, Чубинишвили, 2001). Определение пола и возраста лягушек проводили по стандартной методике (Шляхтин, Голикова, 1986). При учете асимметрии меристических признаков (b_ij) в альтернативной форме, когда при наличии асимметричного признака b_ij = 1, и когда признак симметричен b_ij=0 (Захаров и др., 2000), долю асимметричных признаков вычисляли по формуле (Гелашвили и др., 2001): , где n- количество признаков, j=1,..n, m- количество особей в выборке, i=1,..m., b_ij - асимметричные меристические признаки. Степень отклонения качества среды от нормы определяли по нарушению стабильности развития (по величине ФА) земноводных и оценивали по пятибалльной шкале (Методические рекомендации.., 2003).

Лейкограмма периферической крови. Определение содержания в крови лейкоцитов и количественную оценку основных популяций ядросодержащих клеток периферической крови амфибий проводили общепринятым способом (Меньшиков и др., 1987).

Иммунограмма периферической крови и лимфоидных органов (тимуса и селезенки). Для определения содержания Т-лимфоцитов (Т-РОЛ%) использовали метод розеткообразования с эритроцитами курицы. В-лимфоциты (В-РОЛ%) определяли в тесте розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными антителами к иммуноглобулинам лягушки (Исаева, Вязов, 1996). Определение содержания нулевых клеток проводили по формуле: нулевые клетки, % = 100% - (В-РОЛ% + Т-РОЛ%).