Автореферат: Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания

Фагоцитарная активность. Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по способности поглощать клетки пекарских дрожжей (Иммунологические..,1988).

2.2.7 Статистический анализ

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием параметрических (критерий Стьюдента, в том числе с поправкой Бонферрони, дисперсионный однофакторный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса) и непараметрических (коэффициент ранговой корреляции Спирмана, критерий Крускала-Уоллеса, критерий Манна-Уитни, критерий Фридмана) методов математической статистики. За величину уровня статистической значимости принимали р=0,05.

2.2.8 Методы обобщения экспериментальных данных

Для интегральной характеристики качества окружающей среды применяли обобщенную функцию желательности (Адлер и др., 1976; Максимов, 1980; Kaitala, Maximov,1986; Носов, Булгаков, Максимов, 1997; Гелашвили, Чупрунов, Иудин, 2004).

3. Оценка иммунотропных характеристик и идентификация зоотоксинов

Согласно токсинологической классификации, ядовитые животные могут быть разделены на две большие группы: первично-ядовитые и вторично-ядовитые (Павловский, 1950; Орлов, Гелашвили, 1985). К первично-ядовитым животным относятся организмы, вырабатывающие ядовитый секрет в специальных железах или имеющие ядовитые продукты метаболизма в тканях и органах. Ядовитость этих животных является видовым признаком и встречается у всех особей данного вида. Вторично-ядовитые - аккумулируют экзогенные яды в своем теле и проявляют токсичность только при попадании внутрь другого организма.

Первично-ядовитые по способам выработки яда и его применения делятся на активно- и пассивно-ядовитых. Активно-ядовитые животные, имеющие специализированный ядовитый аппарат, снабженный ранящим устройством, позволяющим им вводить яд в тело жертвы минуя пищеварительный тракт, называются вооруженными. Другая группа активно-ядовитых животных, ядовитые аппараты которых лишены ранящего приспособления, относятся к невооруженным. Яды этих животных выполняют в основном, защитные функции, т.е. являются отпугивающими веществами. У пассивно-ядовитых животных ядовитые метаболиты вырабатываются в организме, накапливаются в различных органах и тканях и эффективны при попадании с пищей.

Первой стадией исследования иммунотропных свойств физиологически активных веществ является оценка их иммуногенной активности. В данной серии экспериментов исследовали белковые яды змей: гадюки обыкновенной - Vipera berus L. и гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., класс Reptilia, сем.Viperidae, а также, гемолимфу колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata Say., класс Insecta, сем. Chrysomelidae.

Использование иммуноферментного анализа (ПАП-метод) (Новиков, Андреев, 1987), позволило выявить иммуногенные свойства практически не изученного в иммунологическом аспекте белкового зоотоксина - гемолимфы колорадского жука. Действие гемолимфы было дозозависимым: титр антител в сыворотке крови иммунизированных животных после трехкратной иммунизации, превышал аналогичный показатель после однократной иммунизации (рис. 1).

Рис. 1. Уровень накопления антител, специфичных к гемолимфе колорадского жука, в сыворотке крови животных при однократной (1) и трехкратной (2) иммунизации.

По оси ординат - величина светопропускания (длина волны = 492нм).

При оценке активности сывороток животных, иммунизированных ядом гюрзы среднеазиатской, также были выявлены специфичные к яду антитела. Данная система позволяла оценить иммуногенную активность близких по химическому составу змеиных ядов сем.Viperidae (рис.2). Титры антител в сыворотках крови экспериментальных животных при иммунизации ядами змей, относящихся к одному семейству, статистически значимо различались между собой, что показывает возможность применения ПАП - метода для оценки видовой принадлежности змеиных ядов.

Рис. 2. Оценка иммуногенной активности змеиных ядов методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого препарата моновалентной сыворотки «Антигюрза».

По оси ординат - значение оптической плотности растворов (отн. единицы) при л = 492 нм.

Другим методическим приемом, вносящим ясность в идентификацию животных ядов, является использование гемокоагуляционных тестов (Руководство по…, 1980; Баркаган, 1977, 1985). Воспроизведение классической методики при работе с ядами змей сем. Viperidae не позволяет различить зоотоксины, т.к. границы доверительных интервалов значений индексов коагулянтности ядов перекрываются. Так, значение индекса коагулянтности для яда гюрзы среднеазиатской составляет - (62,74 80,89), а для гадюки обыкновенной - (60,91 74,25).

Таблица 2 Время рекальцификации (с) цитратной плазмы под действием змеиных ядов

Решить задачу можно, если, во-первых, определять абсолютное время свертывания стандартизированного образца цитратной плазмы и, во-вторых, использовать в качестве субстрата последовательно два образца плазмы: богатой и бедной тромбоцитами. В первом случае установлено, что абсолютное время свертывания под действием яда гадюки почти в 2 раза превышает время свертывания цитратной плазмы под действием яда гюрзы (табл. 2). Исходя из известной зависимости гемокоагуляционной активности яда змей от наличия в плазме тромбоцитарных факторов и фосфолипидных мембранных матриц (кефалина) (Баркаган и др., 1988; Баркаган и др., 1995), дальнейшее определение строится на вычислении отношения времени свертывания плазмы, бедной тромбоцитами к времени свертыванию плазмы, богатой тромбоцитарными факторами под действием каждого яда. Для яда гадюки это отношение 1,5 (1,141,86) было статистически значимо выше, чем для яда гюрзы 1,08 (0,79 1,38), р=0,037. Полученные данные позволяют успешно применять модифицированный метод коагулазной активности в целях идентификации и дифференцировки зоотоксинов.

Таким образом, впервые выявлена иммуногенная активность гемолимфы колорадского жука и создана методическая база для определения близких по химическому составу змеиных ядов, являющихся основой для разработки новых лекарственных средств с широким спектром физиологической активности. Выявление закономерностей функционирования иммунной системы организма-реципиента под действием ядов животных, относящихся к разным токсинологическим группам, предполагает необходимость изучения особенностей проявления гуморальных и клеточных форм иммунного реагирования. Решению этой задачи посвящены следующие главы работы.

4. Гуморальные механизмы поддержания гомеостаза при экспериментальном воздействии зоотоксинов (модель первичного иммунного ответа)

Эволюционно возникшая и развившаяся иммунная форма защиты организма представлена многообразием клеточных и молекулярных участников, среди которых выделяют две взаимосвязанные формы иммунного реагирования: В - (гуморальная) и Т - (клеточная). Ни одна из систем не работает автономно, комплексно они создают мощный заслон от любого чужеродного в антигенном отношении материала, с которым может столкнуться организм в течение онтогенеза. Настоящая глава посвящена оценке характера действия зоотоксинов на специфические гуморальные реакции. Модельной экспериментальной системой in vivo гуморального ответа являлся метод локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965). Данная модель позволяет изучить зависимость влияния зоотоксинов на динамику первичного иммунного ответа от дозы и времени введения.

4.1 Эффекты ядовитых секретов вооруженных активно-ядовитых животных

Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L.). Установлено, что нативный пчелиный яд в зависимости от дозы вызывал разнонаправленные изменения в реакциях гуморального иммунитета. В малых дозах (0,02 ЛД₅₀) пчелиный яд обладал стимулирующим действием на иммуногенез. В широком диапазоне более высоких концентраций (ЛД₁₀ - ЛД₅₀) яд пчел угнетал процесс накопления антителообразующих клеток (АОК) в селезенке (рис.3) и выработку антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей. Действие яда было сильнее выражено при его инъекции до введения эритроцитов барана (ЭБ).

Рис.3. Влияние пчелиного яда на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Кроме нативного яда, в реакциях гуморального иммунитета были исследованы иммунотропные свойства очищенного аллергена из пчелиного яда. У всех сенсибилизированных свинок при внутривенном введении разрешающей дозы аллергена из яда пчел развивался анафилактический шок различной степени выраженности (от 1,5 до 3,0 баллов). Установлено, что анафилактогенная активность аллергена (2,38±0,41) не уступала аналогичным свойствам нативного яда пчел (2,33±0,42, р=0,870). Проявление анафилактической реакции было строго специфичным. Высокие иммуногенные свойства аллергена из яда пчел проявлялись и в реакции пассивной кожной анафилаксии. Титр специфических кожно-сенсибилизирующих антител в сыворотках крови морских свинок, сенсибилизированных аллергеном из яда пчел (200 мкг белка яда), составлял 1:512 - 1:1024. Наличие анафилактогенных и иммуногенных свойств соответствует требованиям, предъявляемым к аллергенным препаратам, которые могут быть использованы при диагностике и лечении аллергических заболеваний, вызванных ужалениями пчел.

Яд скорпиона кавказского (Buthus caucasicus Nordm.). При изучении действия яда скорпиона на реакции гуморального иммунитета было установлено, что он обладал модулирующим действием на формирование первичного иммунного ответа к Т-зависимому антигену. Для яда скорпиона была характерна дозовая зависимость. Наименьшая из исследованных доз яда (0,04ЛД₅₀) не вызывала изменений количества АОК и количества выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке крови. Увеличение дозы яда в интервале значений (0,09ЛД₅₀ - 0,4ЛД₅₀), приводило к стимуляции иммуногенеза, что находило отражение в увеличении числа АОК селезенки. Наибольшая из исследованных доз яда (0,6 ЛД₅₀) проявляла супрессорное действие (рис.4). Выявлено, что яд скорпиона не влиял на иммунокомпетентные клетки, находящиеся в фазе G₀ клеточного цикла, а активно действовал на процессы, развивающиеся вслед за антигенным стимулом, и пролиферативную стадию иммунного ответа.

Таким образом, установлено дозозависимое действие яда скорпиона на первичный иммунный ответ.

Рис.4. Влияние яда скорпиона кавказского на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при одновременном введении с антигеном (ЭБ). По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Яд среднеазиатской гюрзы (Vipera lebetina L.). Наименьшая из исследованных доз яда (0,01ЛД₅₀) не вызывала изменений в реакциях гуморального иммунитета. Увеличение дозы вводимого яда (0,1ЛД₅₀) приводило к подавлению синтеза антителообразующих клеток (АОК)(рис.5). Более чувствительны к действию яда незрелые лимфоидные клетки. Яд гюрзы не вызывал изменения в выработке антиэритроцитарных антител в сыворотки крови мышей в динамике первичного иммунного ответа.

Рис.5. Влияние яда гюрзы среднеазиатской на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.

Для снижения токсичности яда гюрзы и возможности дальнейшего изучения иммуногенных свойств зоотоксина мы получили его липосомальную форму. Использование липосом, как носителя яда, обеспечивает более высокий иммунный ответ на включенный или распределенный на их поверхности антиген (Липосомы.., 1983; Марголис,1986; Baneryi, Alving,1990) и снижает токсичность змеиных ядов (New et al., 1985; Freitas et al.,1989; Radvanyi et al., 1989). Установлено, что более эффективно захватывали яд липосомы, изготовленные методом обращения фаз (70,0±3,0 % нативного яда). Для контроля распределения яда липосомы нагружали кальцеином в концентрации самотушения (40 мкмоль) и исследовали возбуждение флуоресценции в присутствии или отсутствии детергента. Показана преимущественная локализации антигенов яда во внутреннем пространстве замкнутых фосфолипидных липосом. Рассчитанная методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963) средняя смертельная доза (ЛД₅₀) нативного яда составила 2,22 (1,07 ч 3,37) мг/кг, а липосомальной формы - 6,9 мг/кг, что свидетельствовало о снижении более чем в три раза токсичности нативного яда при его включении в липосомы. Включение яда в токсической дозе (1,0 ЛД₅₀) в липосомы не вызывало летальности мышей, при этом титры специфических антител в сыворотках крови этих животных уже на 7 сутки иммунного ответа (8,38±0,38, р<0,001) были гораздо выше по сравнению с титрами антисывороток животных, иммунизированных свободным ядом (4,11±0,10), либо липосомами, содержащими яд в дозе 0,04 ЛД₅₀ (4,21±0,13) (рис.6).