Рис.6. Уровень накопления антител, специфичных к яду гюрзы среднеазиатской (Vipera lebetina), на седьмые сутки после иммунизации животных свободным ядом (0,04 ЛД50) и ядом, включенным в липосомы. По оси ординат - величина оптической плотности растворов (отн.единицы) при длине волны 492 нм.
Таким образом, установлено снижение первичного иммунного ответа в условиях введения яда гюрзы (Vipera lebetina L.). Уменьшение антителообразования более выражено в индуктивный период антителогенеза. Внутрибрюшинное введение токсической дозы яда, инкапсулированной в липосомы не вызывало гибели животных. Липосомальная форма яда вызывала стимуляцию выработки специфических антител, что свидетельствовало о перспективах ее применения для производства антисывороток и защитной иммунизации против яда среднеазиатской гюрзы.
4.2 Эффекты ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных
Яд жабы зеленой (Bufo viridis Laur). Однократное внутрибрюшинное введение яда в дозе 0,01ЛД50 в различные сроки по отношению к началу иммунизации, вызывало ярко выраженный стимулирующий эффект. Более высокий уровень иммунокомпетентных клеток отмечен нами при инъекции яда до антигена. Яд жабы в дозах 0,08ЛД50 - 0,25ЛД50 оказывал подавляющее действие на число АОК. Заметим, что степень снижения уровня АОК определялась не столько концентрацией введенного токсина, сколько зависела от срока его введения (рис.7).
Таким образом, на модели первичного иммунного ответа для яда жабы зеленой установлена зависимость «доза-эффект» и «время-эффект».
Рис. 7. Влияние яда жабы зеленой на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа. По оси ординат - число АОК в % к контролю, принятого за 100%.
4.3 Эффекты ядовитых секретов пассивно-ядовитых животных
Гемолимфа колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). Иммунотропные эффекты гемолимфы колорадского жука обуславливались как величиной введенной дозы, так и временем исследования. Совместное введение гемолимфы (в дозах 0,07ЛД50-0,4ЛД50) с тимусзависимым антигеном приводило к более интенсивной ответной иммунной реакции, чем при введении только эритроцитов барана. Пик стимуляции соответствовал дозе 0,07ЛД50, которая вызывала почти трехкратное увеличение количества АОК по сравнению с контролем (рис.8).
Дальнейшее увеличение дозы гемолимфы вызывало угнетение процессов антителообразования. Наиболее значительная супрессия наблюдалась при введении гемолимфы до иммунизации. Оценка титров антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей подтвердила выявленные эффекты гемолимфы. Таким образом, установлено дозозависимое действие гемолимфы колорадского жука в отношении гуморальной формы иммунного реагирования, выражающиеся в стимуляции при введении малых доз и угнетении в больших дозах.
Рис. 8. Влияние гемолимфы колорадского жука на процесс накопления антителообразующих клеток в селезенке мышей на 4-5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат - число АОК на 106 клеток селезенки.
Несмотря на определенную специфичность действия зоотоксинов на формирование гуморального иммунного ответа, отчетливо выявлены общие закономерности, обусловленные токсинологическим статусом организма-продуцента. Низкие дозы активно- и пассивно-ядовитых животных (гюрза среднеазиатская, пчела медоносная, скорпион кавказский, жаба зеленая, колорадский жук) стимулируют, высокие, напротив, угнетают формирование гуморальных иммунных реакций. Яды активно-ядовитых животных, меняя амплитуду иммунного ответа, не извращают его динамику. Стимуляция гуморальных реакций ядом пассивно-ядовитых животных (колорадский жук) обеспечивается, по-видимому, включением в процесс антителообразования большего числа клеток-предшественников, что вызывает смещение пика максимума выработки антиэритроцитарных антител к более поздним срокам и меняет динамику иммунного ответа (рис.9).
Рис.9. Динамика выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке мышей при введении зоотоксинов разных токсинологических групп По оси абсцисс - сутки первичного иммунного ответа. По оси ординат - величина титров антител (log2 АТ).
5. Клеточные механизмы поддержания гомеостаза при экспериментальном воздействии зоотоксинов (модель реакции гиперчувствительности замедленного типа)
Результаты, полученные на модели гуморального иммунного ответа, позволяли полагать, что механизм иммунотропной активности зоотоксинов обуславливался и изменением функциональной активности Т-клеток. Поэтому на следующем этапе, был изучен характер действия зоотоксинов на экспериментальной модели одной из форм клеточного иммунного ответа: реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). Данная методика является классическим способом воспроизведения реакции (Tamura et al., 1983), не предполагает гистологического подтверждения и позволяет оценить адъювантные и супрессорные свойства антигенов.
5.1 Эффекты ядовитых секретов вооруженных активно-ядовитых животных
Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L). Установлено, что пчелиный яд не препятствовал процессу формирования клеточных иммунных реакций в модели ГЗТ. Наименьшая из исследованных доз (0,01ЛД50) стимулировала формирование реакции. Стимулирующие свойства яда проявлялись как при воспроизведении реакции ГЗТ с адъювантом (оценка супрессорных свойств), так и без него (оценка стимулирующих свойств). Эффекты суммации адъювантных свойств яда и красителя отсутствовали. Выраженность реакции ГЗТ при использовании пчелиного яда в дозе (0,1ЛД50) была незначительной. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии стимулирующих эффектов при использовании пчелиного яда в большой дозе.
Змеиные яды. Для анализа были взяты ядовитые секреты змей сем. Viperidae: гадюки обыкновенной - (Vipera berus L.), гюрзы среднеазиатской - (Vipera lebetina L.), эфы песчаной - (Echis carinatus Schneid.), гадюки Никольского - (Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva); а также липосомальная форма яда гюрзы среднеазиатской.
Яд гюрзы (0,1ЛД50) оказывал супрессорное действие на воспроизведение реакции ГЗТ к обоим антигенам. Так, при сенсибилизации животных ЭБ индекс реакции (ИР) составлял 3,57±0,90% (р=0,119), т.е. статистически значимо не отличался от показателя у интактных животных (5,88±1,06%). Аналогичные результаты получены при моделировании реакции ГЗТ к МБСА. В этих опытах ИР составлял 5,03±0,90%, р<0,001 (18,15% от значения «положительного» контроля) и не отличался от «отрицательного» контроля (р=0,833), что свидетельствовало о полном подавлении реакции ГЗТ. Снижение дозы яда (0,01ЛД50) приводило к формированию клеточных иммунных реакций. Эта доза яда обладала четким адъювантным эффектом в обеих моделях реакции ГЗТ к МБСА и ЭБ и стимулирующей активностью в отношении специализированных популяций Т-клеток, участвующих в формировании клеточного звена иммуногенеза. Адъювантные свойства яда гюрзы были сравнимы с действием красителя, эффекты суммации отсутствовали.
Яды гадюки обыкновенной (0,25ЛД50) и гадюки Никольского (0,1ЛД50) полностью блокировали развитие клеточных реакций. Яд эфы песчаной (0,04ЛД50) оказывал адъювантное действие в отношении реакции, вызванной МБСА с ЭС. Эффекты суммации адъювантных свойств яда и ЭС отсутствовали. Яд гюрзы среднеазиатской (0,04ЛД50) в форме липосомального препарата значительно стимулировал формирование клеточных иммунных реакций, что, по-видимому, было
обусловлено синергизмом действия компонентов липосомальной формы яда и активацией Т-клеток и макрофагов, принимающих участие в иммунном ответе на антигенный стимул.
Таким образом, змеиные яды в реакциях клеточного иммунитета давали дозозависимый иммунотропный эффект. Большие дозы подавляли, а малые оказывали адъювантное действие и не препятствовали формированию полноценной реакции ГЗТ. Наблюдаемые эффекты следует рассматривать как результат совместного действия мембранно-активных компонентов яда (Орлов, Гелашвили, 1985) на эффекторные и регуляторные клетки, обеспечивающие реализацию клеточных иммунных реакций.
Установлено, что исследованные яды активно-ядовитых животных вызывали изменения антиген-специфических реакций замедленного типа, осуществляемых иммунными Т-клетками. Специфичность действия определялась величиной вводимой дозы (рис.10). При этом пчелиный яд в отличие от яда гюрзы в сопоставимых дозах (0,1 ЛД50) не оказывал подавляющего действия в модельной реакции ГЗТ для оценки супрессорных свойств.
Рис.10. Действие зоотоксинов вооруженных активно-ядовитых животных на воспроизведение реакции ГЗТ, сенсибилизация мышей МБСА без СЭ (оценка супрессорного действия). По оси ординат - Индекс реакции, в %.
5.2 Эффекты ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных
На модели реакции клеточного иммунитета оценивали иммунотропные свойства очищенного препарата секрета кожных желез жаб (Крылов и др., 1980), любезно предоставленного заведующим кафедрой физиологии и биохимии человека и животных ННГУ им. Н.И. Лобачевского профессором В.Н. Крыловым. Очищенный препарат яда жаб обладал способностью вызывать снижение формирования реакции ГЗТ. Степень подавления реакции зависела от дозы и срока введения препарата по отношению к антигенному воздействию. Статистически значимые различия в величине отека отмечены при введении препарата в дозе 0,05ЛД50, через 48 ч после сенсибилизации (38,40±3,13%, р<0,001) и в дозе 0,3ЛД50, через 24 ч после сенсибилизации (47,30±7,14%, р=0,02). Степень подавления реакции в этих группах была максимальной, и ИР практически не отличался от значения отрицательного контроля (39,66± 2,68%). Изменение интервала между введением антигена и очищенным препаратом яда жаб снижало выраженность реакции ГЗТ к соответствующему антигену (рис.11).
Рис. 11. Действие ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа (оценка супрессорных свойств). По оси ординат - индекс реакции в % от показателя положительного контроля.
Таким образом, препарат яда жаб обладал супрессорным действием на формирование иммунологически обусловленной воспалительной реакции. Учитывая, что биологически действующие начала яда жаб относятся к стероидным соединениям животного происхождения (Захаров,1960; Крылов, 1978; Орлов и др., 1980; Albuquerque, 1971) с мощными противоспалительными свойствами (Сейфулла, 1982; Тринус и др., 1987), можно полагать, что подавление реакции ГЗТ обусловлено антивоспалительным действием кардиотонического препарата.
5.3 Эффекты ядовитых метаболитов пассивно-ядовитых животных
Гемолимфа личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). В диапазоне доз (0,07ЛД50 - 0,8ЛД50) белковый токсин пассивно-ядовитых животных (гемолимфа колорадского жука) стимулировала активность Т-лимфоцитов, оцениваемую по реакции ГЗТ. Адъювантные свойства гемолимфы проявляются в обоих вариантах экспериментальной воспалительной реакции (рис.12). Эффекты суммации и супрессорного действия гемолимфы не выявлены.
Рис. 12. Действие гемолимфы колорадского жука на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа. По оси ординат - индекс реакции в % от показателя положительного контроля. А - сенсибилизация мышей антигеном с адъювантом (оценка супрессорных свойств). Б - сенсибилизация мышей антигеном без адъюванта (оценка адъювантных свойств).
Таким образом, оценка иммунотропных свойств зоотоксинов в реакции ГЗТ позволила выявить закономерности изменения клеточных иммунных реакций на природные раздражители внешней среды. Яды первично-ядовитых животных белковой природы оказывали преимущественно стимулирующее действие на формирование экспериментальной воспалительной реакции. Ядовитые секреты вооруженных активно-ядовитых животных в малых дозах не препятствовали нормальному процессу формирования клеточной воспалительной реакции и оказывали адъювантное (стимулирующее) действие. Выраженность клеточных иммунных реакций уменьшалась при возрастании дозы, при этом яд пчелы, в отличие от яда гюрзы, не оказывал супрессорного действия. Ядовитый белковый секрет пассивно-ядовитых насекомых (гемолимфа колорадского жука), не обладал избирательностью действия в отношении клеточных иммунных реакций, но и не препятствовал нормальному процессу формирования реакции ГЗТ. Ядовитый секрет стероидной природы невооруженных активно-ядовитых животных подавлял иммунологически обусловленную клеточную воспалительную реакцию.
6. Модуляция функциональной активности и состояния перекисного окисления липидов (пол) клеток периферической крови зоотоксинами
Важным звеном в реализации патофизиологических реакций является нарушение структурных и функциональных свойств мембран лимфоидных клеток. Одной из наиболее важных причин дезинтеграции клеток является активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Повышение интенсивности ПОЛ приводит к нарушениям матричной и барьерной функции мембран, изменению активности ферментных систем, ослаблению белок-липидных взаимодействий и, как следствие этого, к структурной дезорганизации клеток (Абрамова, Оксегендлер, 1985; Владимиров, Арчаков, 1989). В тоже время имеются лишь фрагментарные данные о влиянии ядов, в частности, яда гюрзы, на процессы ПОЛ, активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов и генерации кислородных радикалов (Орлов, Вальцева, 1977; Корягин, Уткина, Лашина, 1991). Кроме того, изучено воздействие малых доз зоотоксинов (ядов пчелы жабы и саламандры) на активность свободнорадикальных процессов (Корягин, 2007).