Материал: иммунотоксичность_Лимфоциты

Важна также криоконсервация выделенных моноцитов. В отличие от всех других функций клеток хемотаксис у размороженных моноцитов снижен. Присутствие лимфоцитов в клеточной суспензии, загружаемой в камеру, обычно не влияет на хемотаксис моноцитов.

При соблюдении стандартных условий постановки реакции техническая вариабельность результатов составляет около 20%, что вполне допустимо. Воспроизводимость метода весьма высокая. Рекомендуется подсчитывать при микроскопии как минимум 10 случайных полей миграции на 2 идентичных фильтрах. Если перед помещением на фильтры камеры моноциты были хорошо суспендированы, разбросы подсчета клеток в отдельных полях зрения под микроскопом невелики и связаны обычно только с ошибками при самом подсчете.

В следующем разделе мы уделяем внимание ряду методических приемов оценки активности фагоцитарных клеток в генерации многочисленных медиаторных молекул (в первую очередь цитокинов и активных форм кислорода и азота). Все эти факторы врожденного иммунитета крайне важны для нормального функционирования иммунной системы, а особенно - для выявления патологических состояний, характеризующихся сниженной или повышенной выработкой подобных медиаторов.

Лабораторная работа 3-5

Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека

1. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколлверографина. Затем клетки ресуспендируют в среде RРМI 1640, содержащей 2-меркаптоэтанол (5×10^-5 М), с конечной концентрацией 1 х10⁶ клеток в 1 мл.

2. В каждую лунку 24-луночного планшета помещают 1 мл клеточной взвеси МНК и инкубируют в течение 60 мин при 37 °С для получения фракции прилипающих моноцитов. Надосадочную жидкость, содержащую лимфоциты, удаляют.

3. В опытные лунки с прилипшими моноцитами добавляют ЛПС (E. coli), растворенный в RРМI 1640 до конечной концентрации 10 мкг/мл, а в контрольные лунки - равный объем среды RРМI

1640.

4. Через 24 ч культивирования при 37 °С в атмосфере 5% СО₂ проводят центрифугирование при 400 g в течение 8 мин при комнатной температуре; надосадочную жидкость, содержащую цитокины, собирают, стерилизуют фильтрованием (0,2 мкм) и хранят при -20 °С.

5. Супернатант, полученный таким способом, можно использовать для определения концентрации различных цитокинов (провоспалительных, противовоспалительных, колониестимулирующих факторов (КСФ) и др.), секретируемых МНК. Оценку цитокинов проводят методами биологического тестирования (см. гл. 7) или ИФА (см. гл. 4). Кроме того, можно определять содержание оксида азота, противомикробных пептидов и других биологически активных молекул.

Определение выработки активных форм кислорода и оксида азота

Исключительно важную роль как в процессах активации фагоцитов, так и в реализации их кислородзависимой бактерицидной функции играют активные формы кислорода (АФК) и оксида азота, образующиеся в процессе кислородного или дыхательного взрыва.

В основе дыхательного взрыва лежит усиление потребления глюкозы и ее расщепление с участием NADPH+ (по механизму гексозомонофосфатного шунта), сопровождающиеся накоплением NADPH. Взаимодействие NADPH с молекулой кислорода при участии NADPH-оксидазы приводит к генерации супероксид аниона (О₂^-), из которого с участием ионов водорода образуются потенциально токсичные для бактерий гидроксильные радикалы (ОН), перекись водорода (Н₂О₂) и синглетный кислород (¹О₂). Этот процесс начинается спонтанно, после образования фагосомы и перед ее слиянием с лизосомой. Наиболее выраженный бактерицидный эффект реализуется в фаголизосомах. Образование Н₂О₂ происходит спонтанно и при участии супероксиддисмутазы. Фермент миелопероксидаза обеспечивает образование гипохлорида из Н₂О₂ с участием ионов галогенов. Оксид азота (NO) образуется в результате расщепления аргинина до цитруллина и катализируется NO-синтазой (рис. 3.4).

Рис. 3.4. Схема выработки бактерицидных субстанций фагоцитов (активных форм кислорода и оксида азота)

Продукцию АФК фагоцитарными клетками определяют методом хемилюминесценции (ХЛ). Как известно, ХЛ-сверхслабое свечение усиливается люминофорами: люминолом и люцигенином. Люминол позволяет идентифицировать образование перекиси водорода и гипохлорной кислоты, люцигенин - супероксидного радикала. При взаимодействии с АФК люминофоры переходят в возбужденное состояние и при возвращении в исходное испускают квант света, который регистрируется хемилюминометром. Имеются данные о корреляции между выработкой АФК и киллингом бактерий фагоцитами.

Описание метода люминолзависимой хемилюминесценции

В качестве объекта исследования можно использовать суспензию лейкоцитов, мононуклеарных клеток или макрофагов перитонеального экссудата экспериментальных животных. Оптимальное количество клеток для регистрации люминолзависимой ХЛ подобрано экспериментально и составляет 1 млн/мл макрофагов и мононуклеарных клеток крови и 2×10⁵/мл лейкоцитов. Для регистрации хемилюминесценции в термостатируемую кювету хемилюминометра ХЛМ-3 помещают: 1 млн клеток; 2,8 мл раствора Хенкса; 2×10^-5 М люминола («Serva», Германия). Через 3-5 мин регистрируют спонтанную ХЛ. Затем в кювету добавляют 1,43 мкг/мл опсонизированного сывороткой крови человека зимозана («Sigma», США) и регистрируют индуцированную ХЛ.

Затем оценивают интенсивность ХЛ в милливольтах (или в относительных единицах). Спонтанная ХЛ показывает уровень выработки АФК клетками в организме. Индуцированная различными стимуляторами ХЛ отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на стимул. Снижение индуцированной ХЛ может служить одним из признаков нарушения бактерицидной функции фагоцитов. Это демонстрируют результаты кинетики ХЛ-ответа нейтрофилов у больных с генитальным герпесом (рис. 3.5).

Так, у больных с генитальным герпесом спонтанная выработка АФК выше, чем у здоровых доноров. Действие опсонизированного зимозана не стимулирует выработку АФК, она остается на уровне спонтанной выработки и значительно ниже показателей таковой у здоровых доноров, что свидетельствует о снижении противовирусного действия нейтрофилов при генитальном герпесе.

Рис. 3.5. Кинетика ХЛ-ответа нейтрофилов здоровых доноров (черная кривая) и больных с генитальным герпесом (зеленая кривая)

Определение содержания no в супернатантах культуры фагоцитов in vitro

Оксид азота (NO) участвует во многих физиологических и патологических процессах на уровне как клеток, так и организма в целом, выполняя защитное, регуляторное и повреждающее действия.

Регуляторное действие NO проявляется в поддержании тонуса и проницаемости сосудов, в подавлении адгезии тромбоцитов, в модуляции клеточной адгезии, нейротрансмиссии и бронходилатации, а также некоторых функций почек и иммунной системы.

Повреждающее действие оксида азота реализуется через ингибирование ферментативных функций, индукцию процессов перекисного окисления липидов и повреждения ДНК клетки, повышение чувствительности клетки к воздействию радиации, алкилирующих агентов и токсических металлов, а также через истощение антиокислительных возможностей клетки. Непрямое цитотоксическое действие N0 осуществляется за счет модуляции цитокинового равновесия и опосредованной (через ИЛ-12) активации NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Сам по себе NO не является мощным

цитотоксическим агентом, но может усиливать чувствительность клеток к действию других цитотоксических агентов. Наиболее выраженной антимикробной активностью обладают соединения, образовавшиеся при взаимодействии АФК и NО в случае их совместной генерации. В результате взаимодействия NO с АФК и с некоторыми другими соединениями образуются цитотоксические агенты, в том числе пероксинитрит (ONOO), S-нитрозотиолы (RSNO), нитрогендиоксид (МЭ2), динитрогентриоксид (N₂O₃), динитроген-тетраоксид (N₂O₄) и железодинитрозильные комплексы (DNIC). Однако NО может снижать эффективность окислительного взрыва за счет формирования железонитрильных комплексов, что уменьшает способность железа катализировать прооксидантные реакции.

Эффекты NO принято разделять на основные и опосредованные. Основные включают те реакции, в которых он непосредственно взаимодействует со специфическими биологическими молекулами, например с гуанилатциклазой, цитохромом Р450 и др. Опосредованные эффекты связаны не с самим NO, а с реактивными формами азота, образующимися при взаимодействии NO с кислородом или с супероксидным анионом-радикалом.

Основные эффекты NO имеют место при низких концентрациях NO (менее 1 мкM), тогда как побочные (включая образование радикалов) становятся возможными при более высоких концентрациях NO (более 1мкМ).

Оксид азота in vivo образуется с участием NO-синтазы (NOS), которая у млекопитающих существует в трех изоформах: nNOS - нейтральная (тип 1); iNOS - индуцибельная (тип 2); ecNO-синтаза - эндотелиальная (тип 3).

В макрофагальных клетках функционирует iNOS, экспрессию которой стимулируют некоторые цитокины и микробные продукты, часто действующие в синергизме. NOS типов 1 и 3 называют также cNOS - избирательная, которая присутствует в клетках и может быть активирована притоком кальция с последующим его связыванием с кальмодулином. В присутствии iNOS оксид азота вырабатывается в больших количествах и часто дает побочные эффекты, такие, как перекисное окисление липидов и гидроксилирование, образование нитрозаминов и нитротирозина.

Активированный на цитохроме р450 кислород включается в реакцию образования NW-OH-L-аргинина и является участником одного из наиболее важных этапов в зависимой от NOS-реакции -

окислении гуанидинового азота. Затем гидроксилированная форма L-аргинина при участии супероксидных анион-радикалов и гема превращается в L-цитруллин с одновременным образованием NO.

Для оценки продукции NO перитонеальными макрофагами животных или моноцитами периферической крови человека определяют содержание нитрит-аниона (NO^2-) в супернатанте культивируемых клеток (см. Лабораторную работу 3-5) спектрофотометрическим методом с использованием реактива Грисса. Для этого 150 мкл культуральной среды переносят из лунки планшета в пробирку и добавляют последовательно 75 мкл 1,5% раствора сульфаниламида и 1N HCl и 75 мкл 0,15% раствора нафтилэтилендиамминдихлорида в дистиллированной воде (компоненты реактива Грисса). Затем доводят объем раствора до 1 мл. После инкубации в течение 10 мин анализируют оптическую плотность раствора на спектрофотометре (например, на СФ-46) при 540 нм, используя в качестве контроля полную среду культивирования с добавлением раствора Грисса. Продукцию NO выражают в микромолях при помощи калибровочного графика.

Оценка киллинга фагоцитов

Наиболее надежный метод оценки завершенности фагоцитоза - микробиологический, заключающийся в измерении числа бактерий, выживших в лейкоцитах после фагоцитоза.

Принцип метода. Для постановки метода готовят взвесь лейкоцитов и опсонизированных микроорганизмов в соответствующих соотношениях. Через определенные промежутки времени лейкоциты разрушают, делают посевы на питательный агар и через сутки подсчитывают число выросших колоний. Лейкоциты здоровых доноров убивают до 80% бактерий за 20-30 мин (Czuprynski, 1983).

Определение активности миелопероксидазы в лейкоцитах периферической крови

Миелопероксидаза - один из ключевых ферментов фагоцитов, определяющих бактерицидность этих клеток. Сущность метода заключается в добавлении к лизату клеток периферической крови субстрата фермента ортофенилендиамина и перекиси водорода. Развившаяся цветная реакция оценивается по изменению оптической плотности при 492 нм на фотометре.

Снижение уровня миелопероксидазы коррелирует с уменьшением бактерицидности нейтрофилов в отношении стафиллококков.

Особенно снижен уровень этого фермента при хроническом лимфогранулематозе.

Количественная оценка антителообразующих клеток (метод Йерне)

Метод идентификации отдельных антителообразующих (АОК), разработанный и предложенный в 1963 г. Нобелевским лауреатом Н. Йерне и А. Нордином, дает возможность анализировать популяции лимфоидных клеток с точным учетом абсолютного числа АОК. Несмотря на то что прошло более 45 лет со дня сообщения о новом методе, он до сих пор используется при иммунологических исследованиях. Появились новые, получающие все большее распространение способы оценки АОК, но метод Н. Йерне, или, как его еще называют, метод локального гемолиза, или бляшкообразования в агаре, благодаря своей информативности и доступности остается в практике экспериментальной иммунологии, в частности при изучении действия различных факторов (физических, фармацевтических, токсических и др.) на антителообразование у экспериментальных животных. Доступен метод и для иммунологического практикума.

Основной принцип метода локального гемолиза состоит в том, что определенное число клеток лимфоидных тканей (селезенка, лимфатические узлы) мышей, иммунизированных эритроцитами барана, смешивают in vitro с эритроцитами барана и расплавленным, но не влияющим на жизнеспособность клеток агаром. Смесь помещают на чашку Петри и после инкубации при 37 °С в присутствии комплемента визуально подсчитывают число зон гемолиза («бляшек») в агаровой пластинке. В центре каждой «бляшки» находится АОК, представляющая собой плазматическую или лимфобластную клетку. Зная взятое для посева на агар число лимфоидных клеток, можно высчитать количество АОК на фиксированное число кариоцитов (например, на 1 млн или 10 млн) или на целый орган (селезенка).

Прямой способ (принцип описан выше) выявляет АОК, продуцирующие IgM антитела, лизирующие эритроциты в присутствии комплемента.

С помощью непрямого способа (рис. 3.6, см. также цв. вклейку) представляется возможность выявить АОК, продуцирующие IgG антитела (АТ). Для этих целей суспензию клеток дополнительно обрабатывают кроличьей антисывороткой, содержащей АТ против IgG мышей, на пике выработки IgM-АТ. Антисыворотка, содержа-

щая IgM-АТ против IgG мышей, взаимодействует in vitro в агаре с IgG-АТ против эритроцитов барана с присоединением комплемента. Этот комплекс способен лизировать эритроциты. Таким образом, при непрямом методе выявляется сумма АОК, продуцирующих IgM и IgG антитела.

Рис. 3.6. Непрямой метод Йерне: а - схема постановки метода; б - зона гемолиза, в центре АОК

Использование эритроцитов барана, конъюгированных с растворимыми антигенами, дает возможность изучить динамику образования АОК к некорпускулярным антигенам. Метод локального гемолиза в модификации может быть применен для анализа АОК у разных видов животных, а также у человека.