Материал: Ионообменная хроматография
История открытия.
Первооткрывателем хроматографии был русский ученый, ботаник и физиохимик Михаил Семенович Цвет. Исследуя пигменты растений, Цвет пропустил раствор смеси очень мало различающихся по цвету пигментов через трубку, заполненную адсорбентом - порошкообразным карбонатом кальция, затем промыл адсорбент чистым растворителем. Отдельные компоненты смеси при этом разделились и образовали цветные полосы. Согласно современной терминологии Цвет открыл проявительный вариант хроматографии (проявительную жидкостно - адсорбционную хроматографию). Заметный вклад в развитие хроматографического метода внес Г.Шваб (Германия), явившийся основателем ионообменной хроматографии (1937-1940). Дальнейшее развитие она получила в работах советских ученных Е.Н. Гапона и Т.Б. Гапона, которые провели хроматографическое разделение смеси ионов в растворе (совместно с Ф.М. Шемякиным, 1947), а также осуществил высказанную ещё Цветом идею о возможности хроматографического разделения смеси веществ на основе различия в растворимости труднорастворимых осадков (осадочная хроматография,1948).
Современный этап в развитии ионообменной хроматографии начался в 1975 г. после работы Г. Смолла, Т. Стивенса и У.Баумана (США), в которой они предложили новый аналитический метод, названный ионной хроматографией (вариант высокоэффективной ионообменной хроматографии с кондуктометрическим детектированием).
Ионообменная хроматография-это задержание молекул веществ в неподвижной фазе обусловленное их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. В этом варианте хроматографии задержание происходит в результате электростатического взаимодействия разноименно заряженных ионов. В отличие от абсорбции, ионный обмен описывается стехиометрическим химическим уравнением, что важно и для ионной хроматографии. Однако в ионообменниках часто наблюдается и физическая адсорбция. Разделение в этом случае происходит благодаря разному сродству компонентов определяемой смеси к неподвижной фазе и, следовательно, разным скоростям перемещения по колонке. Ионообменная хроматография широко используется для решения многих биохимических проблем в научных исследованиях.
Этот процесс сходен с адсорбционной хроматографией в следствии того, что задержание молекул вещества в неподвижной фазе обусловлено их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. Однако в этом варианте хроматографии задержание происходит не за счет молекулярной адсорбции, а в результате электростатического взаимодействия разноименно заряженных ионов.
На всех наружных и внутренних поверхностях твердых гранул вдоль нитей полимеров и гелей, образующих пространственную сетку, более или менее равномерно распределены ковалентно связанные с этими поверхностями ионогенные группы. В омывающем их водном элюенте они диссоциируют, образуя сетку одноименно заряженных неподвижных ионов. Если молекулы компонентов фракционируемой смеси тоже способны ионизироваться при растворении, причем так, что их суммарный заряд имеет противоположный знак, то они связываются с неподвижными ионогенными группами силами электростатического взаимодействия, оказываясь тем самым фиксированными в неподвижной фазе. Связь эта обратима: ионы одних компонентов могут замещаться на другие или вытесняться находящимися в элюенте контрионами ионогенных групп сорбента, а также специально вводимыми для этой цели в элюент ионами. Происходит обмен ионов, поэтому сорбенты описанного типа называют ионообменниками (ионитами).
Выбор ионообменного сорбента для очистки белка в значительной степени зависит от изоэлектрической точки белка -- pi. При значениях рН, превышающих pi белка, его молекулы приобретают в целом отрицательный заряд и способны адсорбироваться анионным обменником. При рН ниже pi белок будет адсорбироваться катионным обменником. Например, если pi = 4, то в большинстве случаев целесообразно подобрать сорбент, который способен связывать белок при рН > 4. Поскольку при рН > 4 такой белок заряжен отрицательно, то сорбент должен быть анионообменником, например, с диэтиламиноэтильной функциональной группой (ДЭАЭ). Можно было бы использовать рН < 4 и катионообменник, но многие белки в таких условиях нестабильны, либо образуют агрегаты. Если, напротив, белок, который мы хотим очистить, имеет pi = 10, то он будет заряжен положительно в условиях, пригодных, как правило, для ионообменной хроматографии, т. е. при рН около 7. Таким образом, в общем, для белка такого типа мы должны выбрать катионообменный сорбент, например, с карбоксиметильной функциональной группой (КМ), которая при нейтральном рН заряжена отрицательно.
Адсорбирующая способность сорбента сильно зависит от рН и от pi разделяемых белков (рис. 1), но также от качества сорбента, прилагаемого давления и от числа прогонов колонки. Чтобы увеличить срок службы сорбента, его следует тщательно промыть, хранить в подходящем растворителе и не применять рН и давление вне предписанных допустимых пределов.
Рис. 1. Зарядовые свойства анионо- и катионообменников. Анионообменник с ДЭАЭ имеет значительную емкость при низких и средних значениях рН=1-6; катионообменник с КМ имеет высокую емкость при высоких и средних значениях рН=6-14.
На представленном рисунке показаны профили сил удерживания т.н. "слабых" ионообменников, емкость которых значительно зависит от рН подвижной фазы. Также широко распространены "сильные" катионообменники, практически не меняющие свою емкость в широком диапазоне рН. В этих ионитах в качестве ионогенных групп используются или остатки сильных кислот (например, серной) в катионообменниках, или сильные основания (например, четвертичные амины) в анионообменниках. В первом случае катионообменник имеет рабочий интервал рН равен 1-14, а во втором случае - 1-11. На практике при выборе силы обменника следует учитывать множество факторов, например крупные белковые молекулы могут в неподходящих условиях необратимо связываться с "сильными" анионитами.
Разрешающая способность хроматографического разделения зависит преимущественно от типа биомолекул, типа и качества сорбента, ионной силы градиента при элюции, от температуры и от геометрии колонки.
Как уже отмечалось, возможность фракционирования компонентов смеси веществ обусловлена здесь различием в значениях их суммарных зарядов. Последние зависят как от числа и характера ионогенных групп в молекулах, так и от полноты их диссоциации, которую можно контролировать путем выбора рН и ионной силы элюента. Чем больше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль колонки. Так, на рисунке 2 представлен пример разделения аминокислот, имеющих разный заряд.
Рис.2 Разделение имеющих разный заряд аминокислот.
На очерченный здесь основной процесс ионообменной хроматографии влияет ряд дополнительных факторов. Среди них, кроме уже фигурировавшей ранее затрудненной (особенно для крупных молекул) диффузии внутри гранул, следует назвать возможность неионной адсорбции на поверхности матрицы ионообменника. Однако при правильном выборе материала обменника, и в частности его пористости, основную роль в процессе фракционирования играет явление ионного обмена.
Схема типичного прибора для ионообменной хроматографии представлена на рисунке 3.
Рис. 3 Типичная установка ионообменной жидкостной хроматографии для очистки белков. После загрузки образца насос создает солевой градиент для элюции образца.
Основы метода
В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядом, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами.
В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиака, т.е. системы растворителей, имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости и большую тенденцию ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, дозволяющими регулировать значение рН.
При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступать во взаимодействие с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом ионизированы. Можно провести анализ даже нейтральных молекул сахаров в виде их комплексов с борат-ионом.
Ионообменная хроматография незаменима при разделении высокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким соединениям относятся аминокислоты, пептиды, сахара.
Ионообменную хроматографию широко применяют в медицине, биологии, биохимии, для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для разделения неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии проводят за 20-40 мин с лучшим разделением. Применение ионообменной хроматографии в биологии позволило наблюдать за образцами непосредственно в биосредах, уменьшая возможность перегруппировки или изомеризации, что может привести к неправильной интерпретации конечного результата. Интересно использование данного метода для контроля изменений, происходящих с биологическими жидкостями. Применение пористых слабых анионообмеников на силикагелевой основе позволило разделить пептиды. Механизм ионного обмена можно представить в виде следующих уравнений: для анионного обмена