Статья: Механизмы формирования пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе (экспериментальное исследование)

Для выявления пролиферативной активности в ткани легких использовали моноклональные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA), десмину (D33), виментину, альфа-1-антитрипсину, макрофагальному антигену (НАМ56). Все наборы - фирмы DakoCytomation, Дания.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002]. Для этого использовали автоматическую систему обработки изображений «Видеотест-Морфо 3.0» (Россия). Она включала в себя исследовательский микроскоп Micros (Германия) с фотокамерой Pixera (Япония), компьютер с высокоразрешающим цветным принтером и программное обеспечение. Дифференцированному исследованию были подвергнуты участки вблизи корня, а также сегменты, расположенные в каудальном, краниальном и латеральном направлении от него. Рассчитывали объемные доли (мкм³/мкм³) воздуха альвеол, альвеолярного экссудата, соединительной ткани. При цитоморфометрии рассчитывали средние объемы (мкм³) эпителиоцитов и альвеолярных макрофагов, их ядер.

Математическую обработку данных проводили непосредственно из общей матрицы данных EXEL 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ STATGRAPH 5.1 (Microsoft, USA). Она включала определение показателей средней, среднеквадратичного отклонения и ошибки репрезентативности. Для наглядности в необходимых случаях рассчитывали показатели интенсивности роста и прироста на каждом сроке эксперимента [Зайцев В.М., с соавт., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика роста соединительной ткани.

При моделировании хронического ЭТ введением ТХМ и ЛПС на 30-е сутки эксперимента легкие были представлены чередующимися полями эмфиземы, дистелектаза и очагов формирующегося пневмосклероза. Межальвеолярные перегородки были значительно и неравномерно утолщены, что происходило как за счет лимфогистиоцитарной инфильтрации ткани, так и за счет увеличения количества соединительнотканных элементов. Просвет альвеол был свободным, единичные клетки и скопления слизи локализовались преимущественно пристеночно.

Стенка бронхов содержала все слои, но мышечные волокна были атрофированы, окраска их была бледной. Между миоцитами нередко обнаруживались скопления лимфоцитов. В просвете бронхов выявлялись скопления слизи, местами - густо инфильтрированные лимфоцитами и напоминающие по внешнему виду гнойные массы. Такие скопления частично закупоривали просвет отдельных бронхов.

При окраске суданом III липиды выявлялись исключительно в цитоплазме макрофагов в виде многочисленных мелких и более крупных капель, при слиянии принимающих форму полумесяца. Липид-содержащая выстилка альвеол была резко деформирована, содержала складчатости, в отдельных местах липидные массы концентрировались в просвете альвеол.

Новообразование соединительной ткани выявлялось при окраске по ван Гизон, при которой элементы фибротизации отчетливо имели перибронхиальное распространение. В связи с относительно большей плотностью бронхиального дерева вблизи корня легких и в каудальном направлении интенсивность пневмосклероза заметно возрастала в последовательности краниальные области < латеральные < каудальные < область корня легкого. Билатеральной диссиметрии в интенсивности пневмофиброза не выявлялось.

При хроническом ЭТ, вызванном введением гентамицина и бактериального ЛПС картина была в принципе сходной, что отражало общность их пато- и морфогенеза. Легкие имели также неравномерную воздушность: часть альвеол была эмфизематозно расширена до разрывов со слиянием соседних альвеол, часть - с уменьшенным просветом за счет увеличения объема межальвеолярных перегородок.

При окраске по ван Гизон подтверждалось диффузное формирование соединительной ткани, которая, как и в предыдущей серии опытов, присутствовала на срезах не вполне равномерно. Наиболее интенсивно рост соединительной ткани отмечался в прикорневых областях и в каудальном направлении. При окраске по Массону выявлялось, что очаги соединительной ткани в этих местах была представлена рыхлой коллаген-содержащей стромой с небольшим количеством неплотно расположенных фибробластов и не меньшим числом макрофагов.

Таким образом, на 30-е сутки процесса наиболее яркими изменениями в легких являлись утолщения межальвеолярных перегородок. Этот феномен, наш взгляд, имел комплексное происхождение и объяснялся сочетанием следующих процессов: сосудистыми нарушениями, макрофагальной реакцией, пролиферацией фибробластов и накоплением коллагеновых волокон.

В крупных фокусах ателектаза все эти процессы имели максимальную выраженность. В то же время отмечалась регенерация поврежденного ранее альвеолярного эпителия. В альвеолярных макрофагах и фибробластах липиды обнаруживались в виде мелкокапельных включений, количество которых было тем больше, чем ближе клетка располагалась к капилляру. Отмечалось явные различия в интенсивность формирования пневмофиброза, причем наиболее выражено эти процессы протекали в областях легких, прилегающих к корню. В группе с введением ТХМ и ЛПС вышеописанные процессы были выражены в несколько большей степени, по сравнению с аналогичными в группе с введением гентамицина и ЛПС.

На 60-е сутки картина хронического легочного повреждения нарастала. Эмфизематозные и ателектатические участки чередовались по всем областям органа, в зонах ателектаза в большом количестве присутствовала соединительная ткань. Диаметр просвета многих альвеол становился сопоставимым с размерами межальвеолярной перегородки.

При окраске суданом III выявлялись многочисленные включения липидов в цитоплазме альвеолярных макрофагов, в межклеточном пространстве появлялись лишь отдельные внеклеточные скопления липидов. Липидная выстилка альвеол была видимой и прокрашивалась неравномерно.

В легких появлялись участки массивного склероза, через которые проходили деформированные бронхи. Смешанный экссудат и скопления слущенного эпителия в просвете бронхов частично организовывались, значительно сужая и даже обтурируя просвет бронха. Различия в интенсивности новообразования соединительной ткани по различным областям легких несколько сглаживались.

Следовательно, к 60-м суткам в легких продолжалось формирование соединительной ткани. В этот период несколько ослаблялось перибронхиальное и периваскулярное формирование пневмофиброза, но отчетливо выявлялся прирост истинной соединительной ткани в межальвеолярных перегородках. По уровню индукции фиброгенеза в тканях легких экспериментальные группы практически не различались между собой.

К 90-м суткам эксперимента в легких крыс с хроническим ЭТ, вызванным ТХМ и ЛПС явления пневмофиброза были выражены в значительно большей степени. Единичные альвеолы на срезах были отделены тканью, превышавшей их просвет в 1,5-2,0 раза. Ткань межальвеолярных перегородок выглядела неоднородной и представляла собой чередующиеся между собой участки рыхлой соединительной ткани с умеренно полнокровными сосудами и лимфогистиоцитарными инфильтратами.

При окраске суданом III в макрофагах обнаруживалось большое количество липидных капель, между клетками выявлялись крупнокапельные скопления липидов. Липид-содержащая выстилка альвеол была утолщена, а в части альвеол - отслоена и деформирована. Липиды обнаруживались в слизи, окружающей скопления клеток в просвете бронхов и альвеол, вокруг мелких сосудов легочного интерстиция.

При окраске по ван Гизон было хорошо заметным дальнейшее нарастание фиброгенеза в ткани легкого. В противовес ранним срокам опыта, более массивные и плотные участки соединительной ткани обнаруживались в областях легких, расположенных в латеральном и каудальном направлении от корня легкого.

На 90-е сутки ЭТ, вызванного введением гентамицина и ЛПС, изменения в легких носили еще более выраженный характер. Явления пневмосклероза нарастали, так что эмфизематозность альвеол частично уменьшалась, а многие из них были полностью спавшимися. Изменялся клеточный состав экссудата межальвеолярных перегородок. Помимо поврежденных и частично атрофированных эпителиоцитов, гипертрофированных макрофагов, в межальвеолярной перегородке присутствовали также лимфоциты и немногочисленные клетки гранулоцитарного ряда, преимущественно нейтрофилы. Характер распределения соединительной ткани в различных областях легких не отличался от такового в серии с введением ТХМ и ЛПС.

Таким образом, в поздние сроки опыта лидирующим процессом в ткани легких являлся диффузный интерстициальный фиброз. Происхождение последнего было связано как с нарастанием количества фибробластов и компонентов соединительнотканной стромы, так и с активным спадением просвета альвеол. Вследствие обструктивных процессов часто обнаруживались кистозные полости по типу "сотового легкого". В склерозированой ткани и даже в просвете спавшихся альвеол обнаруживались макрофаги, лимфоциты, плазматические и тучные клетки. Особого внимания заслуживала перестройка сосудистой сети, характерная для этого периода времени. Капилляры межальвеолярных перегородок по большей части запустевали, но в очагах соединительной ткани формировалось богатое микроциркулярное русло, не имеющее отношения к аэрогематическому барьеру.

Сравнение двух моделей ЭТ свидетельствовало о том, что на этих сроках более развернутые процессы тканевой перестройки ткани легких происходят при сочетанном введении бактериального ЛПС и гентамицина.

Морфометрические данные дополнили и подтвердили результаты гистологического исследования (табл. 2).

В группе с хроническим ЭТ, вызванном введением ТХМ и ЛПС, при проведении морфометрии выявлено выраженное снижение воздушности альвеолярной ткани: с 60% у животных группы сравнения до 38% - у крыс с хроническим ЭТ. Значительно возрастала объемная доля соединительной ткани. Так, у интактных крыс объем соединительной ткани составлял лишь 0,8±0,2 мкм³/мкм³, у животных опытной группы на 30-е сут. - 12,1±1,0 мкм³/мкм³, а на 90-е сутки данный показатель составил 23,6±0,3 мкм³/мкм³.

Таблица 2

Показатели морфометрии легких при хроническом ЭТ у крыс (M±m)

* - достоверные различия с показателями в контрольной группе

Поскольку качественный анализ выявил различия в темпах и характере прироста соединительной ткани по нескольким условным областям легких, отличающихся близостью к крупным сосудам, бронхам, внутрилегочным лимфатическим фолликулам и т.п., для таких областей показатель ОД соединительной ткани, был повторно рассчитан с использованием окраски по ван Гизон (табл. 3).

Как следует из приведенных данных, если на начальных сроках опыта ОД соединительной ткани была наибольшей в прикорневых и каудальных областях легких, то в последующем по данному показателю достоверных различий уже не наблюдалось. В краниальных и латеральных областях легких между 30 и 90 сутками эксперимента наблюдалось более выраженное приращение ОД соединительной ткани, в то время как в областях, где она формировалась ранее прирост несколько замедлялся, а в области корня легкого между 60-ю и 90-ми сутками - практически отсутствовал.

Сопоставление относительных объемов (рис. 1) соединительной ткани в легких по срокам эксперимента и отделам органа выявил ряд интересных моментов.

Таблица 3

Объемная доля соединительной ткани (мкм³/мкм³) в различных областях легких при хроническом ЭТ у крыс (M±m)

* - достоверные различия с показателями в контрольной группе,

# - с показателями на предыдущем сроке эксперимента

Рис. 1. Показатели интенсивности роста соединительной ткани в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята объемная доля соединительной ткани в данном отделе легких у крыс контрольной группы.

пневмосклероз хронический эндотоксикоз

Из графика видно, что интенсивность роста соединительной ткани была практически равномерной и высокой в каудальных отделах легких, нарастание интенсивности было характерно для краниальных и латеральных областей легких, а низкая и не возрастающая во времени интенсивность - для областей возле корня легких.