Статья: Механизмы формирования пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе (экспериментальное исследование)

Анализ показателей прироста соединительной ткани свидетельствует о том, что максимальная инициализация фиброгенеза имеется на 30-е сутки эксперимента, в то время как в дальнейшем показатели прироста становятся малыми, а для каудальных и прикорневых отделов легких к 90-м суткам - практически отсутствуют.

Иммуногистохимическое исследование.

На 30-е сутки хронического ЭТ, вызванного введением ТХМ и ЛПС, в легких выявлялась гиперэкспрессия макрофагальных антигенов. Макрофаги располагались периваскулярно, а также в толще межальвеолярных перегородок, образуя группы по две-три клетки. При сравнении плотности распределения макрофагов по отдельным областям легких обращало на себя внимание преобладание их в периферических отделах, тогда как вблизи корня легкого в толще соединительной ткани выявлялись лишь единичные клетки. При хроническом ЭТ, вызванном введением гентамицина и ЛПС, существенных отличий в характере тканевого распределения, численной плотности по отделам легких, по сравнению с вышеописанной серией опытов не было выявлено.

К 60-м суткам ЭТ количество макрофагов в легких несколько увеличивалось, в сравнении с предыдущими сроками эксперимента. НАМ-56-позитивные клетки обнаруживались в виде больших периваскулярных скоплений, а также в толще новообразованной соединительной ткани. Макрофаги были крупными, с большим количеством иммунопозитивного материла в цитоплазме клеток.

На поздних сроках опыта (90 суток) существенных отличий в распределении и характере расположения альвеолярных макрофагов не наблюдалось. В стенках бронхов и вокруг крупных сосудов, в сравнении с предыдущим сроком опыта, количетсво макрофагов даже несколько уменьшалось, хотя это были, по-прежнему, крупные клетки, расположенные группами по 5-6 и более.

Еще одной особенностью экспрессии макрофагального антигена в легких на поздних сроках ЭТ являлось отсутствие центро - плеврального градиента распределения макрофагов. степени нивелировались.

Достоверное увеличение размеров ядер макрофагов (до 903,6±46,1 мкм³) по сравнению с ядрами макрофагов интактных животных (666,9±37,8 мкм³, р<0,001), свидетельствовало о возрастании их функциональной активности на высоте эндогенной интоксикации. Для доказательства гистотопографических различий в динамике макрофагальных реакций была применена раздельная морфометрия макрофагов в четырех ранее описанных отделах легких. Наибольшая экспрессия иммунопозитивного материала выявлялась в областях легких, расположенных в латеральном и каудальном направлении от корня органа. При этом максимальный прирост экспрессии был характерен для периода от 30 до 60 суток эксперимента. К 90-м суткам существенной динамики не отмечалось, а в отношении корня легкого показана некоторая тенденция к уменьшению экспрессии НАМ-56. Более показательными эти изменения выглядели при использовании показателей интенсивности роста экспрессии НАМ-56 (рис. 2).

Рис. 2. Показатели интенсивности роста экспрессии НАМ-56 в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята интенсивность свечения по шкале RGB

Из графика интенсивности роста видно, что альвеолярная реакция при хроническом ЭТ была более выражена в латеральных и каудальных отделах легких, в то время как в краниальных отделах - была выражена весьма умеренно. Анализ показателей прироста экспрессии НАМ-56 свидетельствует о том, что максимальная наиболее выраженное увеличение макрофагальной реакции наблюдалось в первые 30 суток эксперимента, а между 60-ю и 90-ми сутками показатель прироста повсеместно менял свой знак на противоположный. Это свидетельствует о постепенном снижении роли макрофагальных реакций по мере увеличения сроков хронической эндогенной интоксикации.

Десмин-позитивные клетки выявлялись в норме в мышечных слоях бронхов, терминальных бронхиол, артерий и артериол, а также в виде единичных миофибробластов в интерстиции и межальвеолярных перегородках.

На 30-е сутки хронического ЭТ, в утолщенных межальвеолярных перегородках такие клетки образовывали группы по 5-6, окруженные макрофагами. Именно такие клетки были рассмотрены как центры формирования заместительного пневмофиброза. В последующем при хроническом ЭТ, вызванном введением ТХМ и ЛПС (в меньшей степени - при процессе, вызванном введением гентамицина и ЛПС) мы наблюдали расширение тяжей, содержащих миофибробласты, которые располагались вне зон прохождения крупных сосудов и, следовательно, являлись результатом пролиферации миофибробластов в местах формирующегося пневмосклероза.

На 90-е сутки хронического ЭТ экспрессия десмина выявлялась практически только в миоцитах стенок артерий и бронхов, отражая их патологические изменения под действием нарастающего пневмофиброза. С этой точки зрения, изменения мышечного слоя сосудов можно было признать более выраженными при введении ТХМ и ЛПС, в сравнении с моделью введения гентамицина и ЛПС.

Виментин был использован в работе как маркер истинных соединительнотканных клеток -фиброцитов и фибробластов. На ранних сроках ЭТ, вызванного введением ТХМ и ЛПС (30-е сутки), виментин экспрессировался в единичных клетках в составе утолщенных межальвеолярных перегородки, а также в фибробластах соединительнотканных перегородок и каркаса ложа крупных сосудов и бронхов. Интерес представляли клетки новообразованной соединительной ткани. которые образовывали короткие тяжи по 4-5 клеток или полукольца, охватывающие артериолы или терминальные бронхиолы. При хроническом ЭТ, вызванном введением гентамицина и ЛПС, к 30-м суткам новообразование соединительной ткани шло аналогичными темпами и по характеру было явно диффузным, так что имелась развитая трехмерно организованная соединительная ткань в составе утолщенных межальвеолярных перегородок. Ход фибробластов в составе естественных соединительнотканных тяжей по ходу бронхов и сосудов легкого, напротив, нарушался, здесь присутствовали элементы разволокнения и частичной деградации ткани.

В более поздние сроки ЭТ виментин-позитивные клетки образовывали обширные группы, их форма все чаще соответствовала зрелым коллаген-продуцирующим фибробластам, между клетками имелись тяжи коллагена. Характер экспрессии виментина по отделам легких в качественном отношении в зависимости от модели ЭТ существенно к 90-м суткам эксперимента не различался.

При исследовании тканевого распределения виментина по показателям интегральной яркости в селектированной фазе было выявлены гистотопографические различия по отделам легких. Как видно из представленных данных, наибольшая экспрессия виментина выявлялась к 30-м суткам в каудальных и прикорневых областях легких. Между 30-ми и 60-ми сутками эксперимента наблюдалось выраженное увеличение экспрессии виментина также в латеральных областях, а между 60-ми и 90-ми сутками эксперимента существенной динамики во всех исследуемых областях не отмечалось.

Для оценки выраженности и направленности процесса формирования фибробластов в легких были рассчитаны показатели интенсивности роста и темпов прироста экспрессии виментина (рис. 3).

Устойчивый рост интенсивности экспрессии наблюдался в латеральных отделах легких, был постоянно высоким - в каудальных отделах, в то время как в области корня легкого рост экспрессии виментина отмечался только на ранних сроках хронического ЭТ. При анализе показателей прироста было отмечено, что максимальная динамика была характерны для экспрессии виментина в каудальных и прикорневых отделах легких в первые 30 суток процесса, в то время как для латеральных отделов легких был характерен умеренный, но постоянный прирост в течение 60-ти суток эксперимента, а для краниальных отделов - умеренные и убывающие во времени темпы прироста экспрессии виментина.

Рис. 3. Показатели интенсивности роста экспрессии виментина в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята интенсивность свечения по шкале RGB в данном отделе легких у крыс контрольной группы.

Способность различных клеток легочной паренхимы к регенерации и, в определенной степени, скорость пролиферации новообразованной содеинительной ткани изучали путем анализа тканевой экспрессии PCNA.

Анализ клеток, иммунопозитивных к PCNA, показал, что на ранних сроках хронического ЭТ (30 суток) преимущественно пролиферируют и/или подвергаются репарации альвеолярные макрофаги (что подтверждено при использовании моноклональных антител к НАМ-56), высоким пролиферативным потенциалом обладают клетки в составе инфильтрата перегородки. Существенной экспрессии PCNA в эпителиоцитах межальвеолярной перегородки не выявлялось, за исключением единичных клеток, что соответствовало естественному (физиологическому) уровню тканевой регенерации. В сравнительном плане между сериями (ТХМ + ЛПС и гентамицин + ЛПС) каких-либо различий не выявлено.

В более поздние сроки опыта экспрессия PCNA в макрофагах была не столь заметной, а в эпителиоцитах - практически не определялась. Иммунопозитивными оказывались группы фибробластов в новообразованной соединительной ткани, а также миофибробласты, что было подтверждено при сопоставлении параллельных серийных срезов с использованием окрасок на виментин и десмин. При этом эспрессия PCNA выявлялась более чем у половины указанных клеток.

Сравнительное иммуногистохимическое исследование различных отделов легких показало, что наиболее выраженная экспрессия PCNA наблюдается вблизи корня легкого, в то время как субплевральные участки практически не реагируют этими компенсаторными изменениями на хроническую эндогенную интоксикацию.

Этот момент был отнесен нами к негативным последствиям интоксикации и рассмотрен в качестве одного из признаков, свидетельствующих о необратимости процесса повреждения ткани легких.

Раздельный подсчет процента иммунопозитивных к PCNA клеток выявил ряд особенностей. Показатели представлены в табл. 4.

Таблица 4

Процент иммунопозитивных к PCNA клеток в легких при хроническом эндотоксикозе (M±m)

*- достоверность по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе при Р<0,05

Как видно из представленных данных, экспрессия PCNA в количественном отношении была умеренно повышена только на 30-60-х сутках эксперимента, но и в это время антиген присутствовал только не более чем в 7,2% клеток. Процент иммунопозитивных макрофагов также варьировал по срокам, превышая при этом показатель контрольных крыс в 2-4 раза: его максимум приходился на 60-е сутки хронического ЭТ, а в последующем фиксировалось достоверное уменьшение. Миофибробласты и фибробласты имели принципиально различную динамику экспрессии PCNA: процент иммунопозитивных фибробластов непрерывно возрастал по срокам эксперимента, в то время как процент иммунопозитивных миофибробластов увеличивался только на 30-е сутки, а в последующем прогрессивно снижался, составляя к 90-м суткам процесс только 45% от такового показателя в легких крыс контрольной группы.

При исследовании экспрессии альфа-1-антитрипсина (ААТ) у животных контрольной группы в легких белок хорошо выявлялся по поверхности бронхиальной выстилки и в бронхоальвеолярной жидкости, а также БАЖ, в тонком слое альвеолярной выстилки и альвеолярных макрофагах. Вокруг некоторых макрофагов наблюдалось диффузное прокрашивание интерстиция, свидетельствующее о высокой антитриптической активности.

В ранние сроки эксперимента количество ААТ в легких было заметно больше, по сравнению с таковым в интактным органом, в просвете альвеол и вокруг гипертрофированных макрофагов обильно выявлялся иммунопозитивный материал.

На 60-е сутки эксперимента экспрессия ААТ в легких оказывалась значительно сниженной, лишь небольшие количества ААТ выявлялись на поверхности альвеолярного эпителия. Участки легкого вблизи артерий слабо окрашивались на ААТ. К 90-м суткам хронического ЭТ материал, иммунопозитивный на ААТ а легких практически не обнаруживался.

Для сопоставления с другими факторами, участвующими в формировании соединительной ткани, было проведено раздельное вычисление интегральной яркости выделенной фазы ААТ по отделам органа. Максимальная экспрессия наблюдалась в каудальных отделах легких на 30-е сутки эксперимента, в других отделах увеличение на этих сроках ЭТ было менее выражено. Начиная с 60-х суток опыта, экспрессия ААТ прогрессивно уменьшалась повсеместно, составляя к 90-м суткам хронического ЭТ менее половины от аналогичного показателя у животных контрольной группы.

Для оценки выраженности и динамики антитриптической активности в легких были рассчитаны показатели интенсивности роста и темпов прироста экспрессии ААТ.

Как видно из рис. 4, выраженный рост интенсивности экспрессии ААТ наблюдался во всех отделах легких, за исключением прикорневых, только на 30-е сутки хронического ЭТ.

Рис. 4. Показатели интенсивности роста экспрессии виментина в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята интенсивность свечения по шкале RGB в данном отделе легких у крыс контрольной группы.

В последующим в этих отделах и вблизи корня показатели интенсивности были менее единицы, что свидетельствовало о снижении экспрессии ААТ в динамике хронического ЭТ.

При анализе показателей прироста было отмечено, что положительная динамика экспрессии ААТ была характерна прежде всего для каудальных отделов легких в первые 30 суток процесса. В последующем было характерно прогрессивное уменьшение (отрицательные показатели прироста), причем снижение активности ААТ происходило повсеместно, но более - там, где предшествующий подъем был максимальным (каудальные отделы), и меньше - где прирост был незначительным (вблизи корня).