Исследуемые пещеры образованы в известняках и доломитах, являющихся отложениями морских бассейнов позднего рифея, венда, кембрия. Время формирования пещер датируется в неогеновым и четвертичным периодами (Цыкин, Цыкина, 1978; Цыкин, 1993). В настоящее время пещеры находятся на сухогалерейной стадии развития и характеризуются отсутствием постоянных и временных водотоков, олиготрофными условиями и низкими температурами (+2..+5°С в зависимости от морфологии и глубины залегания полости) при отсутствии сезонной температурной динамики. Относительная влажность воздуха близка к 100%. Грунт представлен обвальными, хемогенными и остаточными (пещерная глина) отложениями. Из представителей троглофильной и троглобионтной фауны отмечены летучие мыши, а также беспозвоночные (преимущественно Collembola). Начиная с 60-х..80-х г.г. ХХ века в большинстве пещер наблюдается антропогенное загрязнение, степень которого сильно варьирует в зависимости от времени географического открытия, местоположения и доступности конкретной карстовой полости или спелеосистемы.
Рисунок 1. Схема района исследований: I- Аргинский участок, II- Баджейский участок, III- Торгашинский участок, IV - Карауленский участок, V- Бирюсинский участок, VI- Верхне-Базаихский участок, VII- Казанчежский участок, VIII- Столбовский участок, IX- Ефремкинско-Сыйский участок
При планировании исследований использовали опыт ведущих зарубежных биоспелеологов, а также собственный опыт. Изучение культивируемых микроорганизмов проводили методом сбора образцов (sampling) с последующим высевом на питательные среды. В качестве микроорганизмов, способных к росту в условиях пещеры, учитывали только те, которые формировали колонии при +4°С. В экспериментах in situ использовали метод пробных площадок. При изучении антибиотической активности пещерных микроорганизмов в качестве тест-культур использовали фитопатогенные грибы р.р. Bipolaris и Alternaria, выделенные из поражённых органов ячменя и пшеницы.
Глава 3. Численный состав и распространенность микромицетов в пещерах Средней Сибири
Установлено, что микромицеты являются обычными представителями пещерной микробиоты. При этом в распределении грибов в пределах конкретной пещеры, спелеосистемы или грота наблюдается исключительно высокая гетерогенность. Даже в близко расположенных участках численность грибов может варьировать от менее чем 103 до 106 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г. грунта. Не обнаружено статистически значимых связей между удаленностью от входа и численностью пещерных микромицетов (коэффициент корреляции r= -0,137). В наибольшем количестве (105-106 КОЕ на 1 г. грунта) грибы присутствуют в районах с высоким уровнем антропогенного загрязнения, в первую очередь - вблизи подземных стоянок спелеотуристов, а так же вдоль подземных троп (104-105 КОЕ на 1 г. грунта). При наличии подходящего субстрата грибы формируют макроскопические колонии и "плесневые ковры" площадью до нескольких сотен см2. Основным фактором, определяющим численность микромицетов в грунте сибирских пещер, в настоящее время является уровень антропогенной нагрузки. Это проявляется в статистически значимых (p<0,01) различиях в численности грибов между посещаемыми и малопосещаемыми пещерами, а также в статистически значимых (p<0,01) различиях в численности грибов между посещаемыми и малопосещаемыми участками в пределах индивидуальной пещеры (рис. 2). При этом спелеотуристы не только обеспечивают приток необходимой для развития микромицетов органики, но и участвуют в распространении спор и конидий по пещере. В пещерах и спелеосистемах, не посещавшихся человеком до проведения наших исследований, микромицеты не обнаружены.
Рисунок 2. Влияние уровня антропогенной нагрузки на пещеру (слева) и на спелеосистему в пределах индивидуальной пещеры (справа) на численность микромицетов в грунте
Таким образом, для пещер Сибири (за исключением труднодоступных и малопосещаемых спелеосистем) характерна численность микромицетов, не уступающая их численности в лесных почвах и почвах агроценозов, либо превосходящая этот показатель на 1-2 порядка. Это можно объяснить относительно низкой конкуренцией за субстрат в подземной экосистеме, где отсутствуют такие потребители органики, как копро- и некрофаги. Основными субстратами для микромицетов в пещерах являются свечной парафин, обрывки бумаги, древесина, фекалии, волосы, шерсть и другие высокомолекулярные субстраты, на которых грибы, как правило, выигрывают конкуренцию у бактерий. Другим объяснением высокой численности грибов в пещерном грунте является их способность образовывать споры (конидии), которые накапливаются и сохраняются до следующего благоприятного периода.
Глава 4. Биологическое разнообразие микромицетов в пещерах Средней Сибири
В результате проведенных исследований установлено, что в сибирских пещерах присутствует достаточно разнообразная в таксономическом отношении микобиота. Среди распространенных в исследуемых пещерах грибов обнаружены представители 15 родов, относящиеся к пяти отделам: р.р. Pythium, Mucor, Mortierella, Thamnidium, Paecilomyces, Cryptococcus, Rhodotorula, Penicillium, Chrysosporium, Fusarium, Verticillium, Periconia, Trichoderma, Doratomyces, Echinobotryum. В пещере Женевская были отмечены плодовые тела макромицетов р. Coprinus.
Основное число выделенных изолятов приходится на представителей отдела Deuteromycota. Доминирующее положение занимает род Penicillium (34,5% от общего числа изолятов), что характерно для комплексов почвенных микромицетов арктических территорий (Смирнова, 1978; Егорова, 1986; Кирцидели, Томилин, 1997). Широко распространен р. Chrysosporium, который не только входит в комплексы микромицетов 8 из 16 исследованных пещер, но и является преобладающим в пещерах Тёмная и Торгашинская. Обычные для почв Сибири и Дальнего востока представители р.р. Verticillium и Paecilomyces в пещерах встречаются относительно редко. Грибы р. Verticillium обнаружены в трех (Торгашинская, Большая Орешная и Парлагольская), а р. Paecilomyces - в четырех (Торгашинская, Кубинская, Айдашинская и Парлагольская) пещерах. Doratomyces stemonitis и его синанаморфа Echinobotryum atrum представлены в четырех пещерах региона (Караульная, Ледяная, Парлагольская и Маячная). Представители р. Fusarium выделены только из привходовых участков пещер Айдашинская и Ручейная. Широко распространенные в почвах Сибири грибы р. Thriсhoderma в обнаружены только в грунте пещеры Кашкулакская, что может быть связано с длительным использованием пещеры в качестве культового места.
Между карстовыми участками наблюдаются статистически достоверные (p<0,05) различия в таксономической структуре сообществ пещерных микромицетов (рис. 3). Эти различия обусловлены не особенностями участков, а спецификой конкретных карстовых полостей. При этом между отдельными пещерами, в том числе - расположенными в пределах одного карстового участка, наблюдаются значительные и статистически достоверные (p<0,05) расхождения в составе микофлоры, определяемые разнообразием и количеством попадающего в них экзогенного субстрата. В целом, родовой состав микромицетов пещер Сибири соответствует составу микромицетов в прилегающих почвах. Однако для подземных микоценозов характерно пониженное биоразнообразие, а также другое соотношение представителей различных родов по сравнению с микоценозами наземных экосистем.
Рисунок 3. Различия в таксономическом составе пещерных микромицетов между карстовыми участками (вверху), и между отдельными пещерами в пределах карстового участка (внизу, на примере пещер Торгашинская и Ледяная Торгашинского карстового участка)
Кластерный анализ показал, что по частоте совместной встречаемости в пещерах региона микромицеты образуют следующие ярко выраженные группы (кластеры): 1) Penicillium, Chrysosporium, Mucor; 2) Paecilomyces, Verticillium, Doratomyces, Thamnidium, Fusarium; 3) Periconia, Pythium, Echinobotryum, Mortierella, Cryptococcus, Rhodotorula (рис. 4).
Рисунок 4. Результаты объединения микромицетов по частоте совместной встречаемости в сибирских пещерах (метод Варда)
Попадание представителей р.р. Penicillium, Chrysosporium и Mucor в общий обособленный кластер объясняется тем, что представители этих родов являются убиквистами и встречаются практически во всех исследованных пещерах. На их долю приходится 95% всех выделенных изолятов. При этом представители р. Penicillium преобладают в пещерах с высоким уровнем заноса почвы и органического вещества из наземных экосистем, р. Chrysosporium - в пещерах и спелеосистемах с относительно редким поступлением органического вещества и почвы с поверхности, р. Mucor характерен для пещер и спелеосистем с высоким уровнем фекального загрязнения. Кластер, объединяющий представителей р.р. Paecilomyces, Verticillium, Doratomyces, Thamnidium и Fusarium, отражает тот факт, что данные грибы встречаются лишь в пещерах, для которых характерен достаточно высокий занос разнообразной экзогенной органики как природного, так и антропогенного происхождения. Наконец, представители р.р. Periconia, Pythium, Rhodotorula, Cryptococcus обнаружены только в пещере Караульная-2, являющейся уникальной по уровню испытываемой антропогенной нагрузки.
Глава 5. Экологические особенности микромицетов карстовых пещер Средней Сибири
Основным абиотическим фактором в сибирских пещерах является стабильная низкая температура (см. Главу 2). По отношению к температуре встречающиеся в пещерах Сибири грибы можно разделить на три группы: облигатные психрофилы, не способные к росту при температуре выше +22..+24 єС (14% выделенных изолятов), мезофилы, способные к росту при температуре +4єС (46%), а также промежуточные между мезофилами и психрофилами формы, отнесённые нами к психротолерантным (40%) (рис. 5). Эти группы выявлены среди представителей всех обнаруженных в пещерах отделов, за исключением отдела Oomycota. По нашему мнению, различия в температурных оптимумах и температурных пределах роста свидетельствуют о разной степени эволюционной адаптации микромицетов к низким температурам сибирских пещер. Более подробно данный вопрос обсуждается в Главе 9.
численность антропогенный микробный пещера
Рисунок 5. Температурные кривые роста облигатно психрофильных (слева) и психротолерантных (справа) изолятов на примере одноклеточных грибов р. Cryptococcus, выделенных из грунта пещеры Караульная-2.
Между различными пещерами исследуемого региона обнаружены статистически достоверные различия (р<0,01) по относительной встречаемости мезофильных, психротолерантных и психрофильных микромицетов (рис. 6).
Рисунок 6. Примеры различий относительной встречаемости мезофильных, психротолерантных и психрофильных микромицетов в различных пещерах
Температуры, близкие к верхнему температурному пределу роста облигатно психрофильных изолятов пещерных микромицетов (+24єС …+26єС) останавливают их развитие на стадии набухания спор (конидий) либо на стадии образования проростковых трубок. После этого происходит необратимая гибель спор (конидий), и их способность к росту не восстанавливается даже после длительной инкубации при оптимальной температуре (+10єС … +15єС). При сублетальных температурах может отмечаться прорастание спор (конидий) с последующей необратимой остановкой роста на стадии первичного мицелия. При более низких температурах может формироваться разветвленный мицелий. Однако такой мицелий несет ряд дегенеративных изменений: аномально утолщенные и искривленные гифы, сильная вакуолизация клеток. Данный мицелий не способен к формированию органов размножения даже при переносе в благоприятные условия. У психротолерантных изолятов летальные для психрофильных форм температуры вызывают лишь задержку в прорастании спор (конидий) и развитии мицелия. Все выделенные в пещерах мезофильные микромицеты способны к осуществлению полного цикла развития вплоть до образования органов размножения либо покоящихся структур при температуре +4єС, хотя время прохождения цикла при низкой температуре может увеличиваться в 5-10 раз.
Статистически достоверное (p < 0,01) большинство изолятов, выделенных из сибирских пещер, образуют внеклеточные протеазы и амилазы и только 7% не обладают данными ферментами (рис. 7).
Рисунок 7. Распределение пещерных микромицетов по способности к образованию амилолитических и протеолитических ферментов
По мере снижения температурного оптимума наблюдается закономерное (p<0,05) увеличение доли изолятов, не обладающих амилазной и протеазной активностью (рис. 8).
Рисунок 8. Распределение мезофильных, психротолерантных и психрофильных пещерных микромицетов по способности к образованию амилолитических и протеолитических ферментов
Можно предположить, что в связи с олиготрофностью пещерных местообитаний и нерегулярностью поступления высокомолекулярной органики с поверхности, часть микромицетов в процессе адаптации к условиям пещер начинает постепенно переходить к использованию альтернативных субстратов, не требующих наличия амило- и протеолитических ферментов, что ведёт к наблюдаемой нами потере способности к синтезу данных ферментов частью психротолерантных и психрофильных изолятов. Между представителями разных таксономических групп также выявлены статистически достоверные (p<0,01) различия по встречаемости амилолитических и протеолитических изолятов. Так, среди представителей отд. Zygomycota чаще встречаются амилолитические изоляты, не обладающие протеолитической активностью, а среди представителей отд. Ascomycota и Deuteromycota - изоляты, способные одновременно к синтезу и амилаз, и протеаз.
Эксперименты по оценке роли микромицетов в биологическом самоочищении пещер показали, что скорость микробной деструкции высокомолекулярных субстратов, моделирующих различные виды отходов антропогенного происхождения, относительно невысока. Наиболее быстро в условиях пещеры утилизируются целлюлозосодержащие субстраты: бумага, окурки. Убыль массы указанных субстратов после 60 суток экспозиции в пещере может достигать 28-23%. Несколько медленнее разлагается льняная ткань - максимальная потеря массы за 60 суток не превышает 10%. Практически не разлагается за указанный срок образцы парафина (убыль массы < 5%), древесина (убыль массы < 1%).
Скорость микробной деструкции высокомолекулярных субстратов в условиях пещеры статистически значимо (p<0,01) зависит от площади контакта субстрата с пещерным грунтом и влажности грунта. Наблюдаются статистически достоверные (p<0,01) различия между разными участками пещеры по скорости утилизации экзогенных субстратов (рис. 9).