Автореферат: Микробные сообщества карстовых пещер Средней Сибири

Рисунок 14. Разнообразие бактерий, учитываемых на стёклах обрастания (1) и связь между морфологическим разнообразием и численностью бактерий на стёклах обрастания и численностью культивируемых бактерий на примере пещеры Женевская (1) и в целом по пещерам (2)

Однако при сравнении всего массива проб по разным пещерам существенной связи между числом бактерий на стёклах обрастания и их морфологическим разнообразием не выявляется (r = +0,411) (см. рис. 14).

Как и микромицеты, пещерные бактерии представлены мезофилами, способными к росту при +4°С (32% проанализированных изолятов), а также психротолерантными (51%) и психрофильными (17%) изолятами. Соотношение мезофильных, психротолерантных и психрофильных форм в различных пещерах статистически достоверно (р<0,01) различается (рис. 15). Наблюдаемые различия, как и для микромицетов, не связаны с принадлежностью пещеры к конкретному карстовому участку.

Рисунок 15. Типичная температурная кривая роста психрофильных бактерий на примере изолята р. Bacillus, выделенного в пещере Караульная-2 (слева) и примеры соотношения мезофильных, психротолерантных и психрофильных форм в разных пещерах

Среди изолятов, способных к образованию внеклеточных амилаз и протеаз, статистически достоверно (p<0,01) преобладают протеолитические штаммы (рис. 16). Преобладание протеолитических изолятов над амилолитическими, как и отмеченная в главе 6 высокая встречаемость аммонификаторов, свидетельствует о том, что основным субстратом для бактерий в пещерах Сибири служат субстраты животного происхождения.

Рисунок 16. Относительная встречаемость изолятов, способных и не способных к образованию внеклеточных амилаз и протеаз, среди пещерных бактерий

Глава 9. Пути формирования и классификация пещерных микробных сообществ Средней Сибири

Как было показано выше, микробные сообщества пещер Сибири представлены бактериями и грибами, находящимися на разных стадиях адаптации к низким температурам - от психрофилов до мезофилов. При этом психрофильные формы (за исключением неспорообразующих бактерий и одноклеточных грибов в холодных водотоках) в наземных экосистемах региона не обнаружены (Березикова и др. 2005; Воробьёва, Хижняк, 2008). Для объяснения данного феномена нами предложена две альтернативные модели - "эволюционная" и "экосистемная". Согласно "эволюционной" модели, подземные сообщества формируются за счёт способных к росту при +4єС мезофильных микроорганизмов, поступающих из наземных экосистем. В процессе формирования сообщества происходит размножение и эволюционная адаптация микроорганизмов к низкотемпературным условиям (рис. 17).

Рисунок 17. Схема формирования микробного сообщества по эволюционной модели (слева) и поведение модели при разных скоростях притока аллохтонной микробиоты (справа): 1 - низкая скорость притока, 2 - высокая скорость притока

Адаптация к низким температурам заключается в повышении удельной скорости роста при низкой температуре в ряду "мезофилы > психротолеранты > психрофилы" (соответственно µM, µPf и µ Pt на рис. 17); скорости адаптации к низкой температуре (коэффициенты k1 и k2 на рис. 17) малы по сравнению со скоростями притока и размножения. Компьютерный анализ модели показал, что в ходе формирования сообщества в условиях субстратного лимитирования будет наблюдаться всплеск относительной встречаемости "промежуточных (психротолерантных) форм с последующим их вытеснением. В эволюционно зрелом сообществе микроорганизмы будут представлены только автохтонными психрофильными и аллохтонными мезофильными формами. При этом, варьируя скорость притока аллохтонной микробиоты и время формирования сообщества, можно получить все наблюдаемые на практике соотношения численности мезофильных, психротолерантных и психрофильных форм в пещерном сообществе.

В качестве альтернативной модели нами рассмотрена "экосистемная". В данной модели психрофильные и психротолерантные формы рассматриваются в качестве реликтовых со времён оледенений, а их одновременное присутствие в пещерах объясняется разделением ресурсов согласно оптимизационной модели (Суховольский, 2004). Однако против данной модели свидетельствует тот факт, что распределение психрофильных, психротолерантных и мезофильных грибов в индивидуальных пещерах и в целом по пещерам региона отличается от распределения Парето (рис. 18). Аналогичное распределение бактерий по отдельным пещерам и в целом по массиву пещер соответствует Парето. Однако среди бактерий, как и среди грибов, преобладающими формами являются психротолерантные, которые показали пониженную конкурентоспособность +4єС по сравнению с психрофилами в модельных экспериментах.

Рисунок 18. Распределение психрофильных (Пф), психротолерантных (Пт) и мезофильных форм в пещерах региона в логарифмических координатах

На основе полученных данных и "эволюционной" модели нами предложена классификация микробных сообществ сухогалерейных карбонатных пещер умеренной климатической зоны. В основу классификации положены факторы, определяющие состав сообщества (табл. 4).

Таблица 4. Классификация микробных сообществ холодных карбонатных пещер сухогалерейной стадии развития

Сообщества 1A-1C присутствуют в привходовых частях пещер, куда осуществляется занос почвы, растительных остатков и микробного пула из прилегающей наземной экосистемы. Представлены комплексом мезофильных почвенных микроорганизмов, способных к росту при низких температурах. Численность и качественный состав микроорганизмов близки к аналогичным показателям для прилегающих почв. В сообществах 1B и 1C присутствуют психрофильные формы, однако их относительная численность мала. Сообщества 2А-2C и 3А-3С присутствуют в основной части пещеры. Представлены гетеротрофными бактериями с преобладанием аммонификаторов. Численность культивируемых бактерий в сообществах 2A-2C составляет 10⁵..10⁶ КОЕ/г, в сообществах 3A-3C - 10⁶ КОЕ/г. В сообществах 2B и 3B преобладают психротолерантные, а в сообществах 2C и 3C - психрофильные формы. Сообщества 4A-4C отличаются максимальной численностью и разнообразием входящих в них микроорганизмов. Представлены аллохтонными и автохтонными бактериями и грибами. Численность грибов достигает 10⁶, численность культивируемых бактерий - 10⁷ КОЕ/г. Соотношение представителей различных эколого-трофических групп определяется характером антропогенного загрязнения. В сообществах 4B преобладают психротолерантные, а в сообществах 4C - психрофильные бактерии и грибы. При наличии в пещере сообществ 1B-1C, 2B-2C, 3A-3C психротолерантные и психрофильные формы могут преобладать и в сообществах 4A. Сообщества 5A-5C по составу близки к сообществам 2А-2C и 3А-3С, но отличаются меньшими численностями (10³..10⁴ КОЕ/г) и меньшим разнообразием бактерий. В пещерах Средней Сибири нами обнаружены сообщества всех перечисленных типов, с преобладанием 1B-5B.

Глава 10. Перспективы практического использования пещерных микроорганизмов

В последнее десятилетие в мире наблюдается растущий интерес к использованию психрофильных микроорганизмов в биотехнологии (Russell, 1998; Lettinga et al., 2001; Margesin et al., 2008). Наши исследования показали, что карстовые пещеры Средней Сибири являются уникальным природным источником психрофильных и психротолерантных микроорганизмов, в том числе - перспективных для использования в сельскохозяйственной биотехнологии в качестве безопасных для теплокровных и способных к функционированию в низкотемпературных условиях начала вегетационного периода биофунгицидов.

Так, среди выделенных в пещерах психрофильных бактерий и грибов обнаружена высокая встречаемость изолятов, подавляющие развитие фитопатогенных грибов р. Bipolaris, являющихся одними из наиболее распространённых и вредоносных возбудителей заболеваний зерновых, а также фитопатогенных грибов р. Alternaria. По частоте встречаемости антагонистов пещерные сообщества статистически достоверно (p<0,01) превосходят сообщества почв региона, и даже превосходят по этому показателю к микробным сообществам почвоподобных субстратов, получаемых в результате биоконверсии соломы и характеризующихся высокой антифунгальной активностью (Хижняк и др., 2008; Nesterenko et al., 2009).

Распределение пещерных изолятов по антибиотической активности имеет ярко выраженную двухвершинную форму (рис. 20). Относительная встречаемость сильных антагонистов в пещерах с низкой и умеренной степенью антропогенного загрязнения статистически достоверно (p < 0,05) выше, чем пещерах с высокой степенью антропогенного загрязнения (см. рис. 20). Это отмечено как для бактерий, так и для грибов. Данный феномен можно объяснить менее интенсивной конкуренцией за субстрат в антропогенно загрязнённых пещерах, что позволяет развиваться бактериям и грибам с низкой антибиотической активностью. В то же время в пещерах с низким уровнем антропогенного загрязнения в условиях жёсткого субстратного лимитирования преимущественно развиваются штаммы с высокой антагонистической активностью по отношению к потенциальным конкурентам.

Ряд выделенных штаммов показали высокую эффективность в борьбе с корневой гнилью в лабораторных экспериментах с искусственным заражением пшеницы грибами р. Bipolaris (см. рис. 20) и высокую конкурентоспособность в условиях низких температур начала вегетации, и в настоящее время проходят полевые испытания в качестве биофунгицидов на базе ОПХ Минино Красноярского НИИСХ.

Рисунок 1 - распределение пещерных изолятов по антибиотической активности; 2 - относительная встречаемость сильных антагонистов в пещерах с низким и высоким уровнем антропогенного загрязнения; 3 - влияние обработки пещерными изолятами (108, 31 и 85 - грибы; ВДР5, ВДР7 и ВДР10 - бактерии) на интенсивность развития корневой гнили (%) у проростков пшеницы.

Наряду с микроорганизмами, перспективными для использования в сельскохозяйственной биотехнологии, в пещерах региона нами обнаружены психротолерантные углеводородокисляющие бактерии, перспективные для использования в биоремедиации загрязненных нефтепродуктами почв в условиях низких температур.

Выводы

1. Микробные сообщества карстовых пещер Средней Сибири представлены способными к росту при температуре +4°С грибами и бактериями, численность и которых сопоставима с численностью микроорганизмов в наземных экосистемах, а в отдельных случаях и превосходит таковую.

2. В распределении микроорганизмов в пещерах и отдельных спелеосистемах наблюдается высокая гетерогенность, проявляющаяся в варьировании их численности на 2-3 порядка даже в пределах одного грота. Численность грибов в грунте пещер может достигать 10⁵-10⁶ КОЕ на 1 г. грунта. Численность культивируемых бактерий в грунте пещер варьирует от 10³ до 10⁷ КОЕ на 1 г., в подземных водоёмах - от 10² до 10⁵ КОЕ на 1 мл.

3. Грибы в пещерах Средней Сибири представлены р.р. Mucor, Penicillium, Chrysosporium, Pythium, Mortierella, Fusarium, Verticillium, Periconia, Thrihoderma, Paecilomyces, Thamnidium, Doratomyces, Echinobotryum, Cryptococcus, Rhodotorula.

4. В активно посещаемых пещерах ведущая роль в формировании комплексов грибов принадлежит антропогенному фактору, определённый вклад также вносит естественный занос почвы и растительных остатков в привходовые участки пещер. В не посещавшихся человеком пещерах и спелеосистемах грибы не обнаруживаются, за исключением привходовых участков.

5. Относительная встречаемость представителей разных родов микромицетов в карстовых полостях Средней Сибири не связана с принадлежностью пещеры к конкретному карстово-спелеологическому участку, а определяется спецификой конкретной полости. Представители р. Penicillium преобладают в пещерах с высоким уровнем заноса почвы и органического вещества из наземных экосистем, р. Mucor - в пещерах с высоким уровнем антропогенного, в том числе - фекального, загрязнения, р. Chrysosporium - в пещерах с относительно редким поступлением органического вещества с поверхности.

6. Среди способных к росту при +4°С бактерий во всех изученных пещерах обнаружены грамположительные и грамотрицательные бактерии основных эколого-трофических групп, встречающихся в водных и почвенных экосистемах. Среди обитающих в пещерах бактерий идентифицированы представители р.р. Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Actinomyces. Хемоавтотрофные бактерии, за исключением аллохтонных нитрификаторов в грунте пещер Караульная-2 и Ледяная (до 1,4 х 10⁴ КОЕ/г), не обнаружены.