Автореферат: Модулирующее действие дофамина на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

03.00.13. - Физиология

МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ДОФАМИНА НА ПОТЕНЦИАЛ-АКТИВИРУЕМЫЕ И ХЕМОУПРАВЛЯЕМЫЕ ТОКИ МУЛЬТИПОЛЯРНЫХ НЕЙРОНОВ СПИННОГО МОЗГА ПЕСКОРОЙКИ

Букинич Анна Александровна

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009

Работа выполнена в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН Н. П. Веселкин) Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова РАН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией эволюции межнейронного взаимодействия

Н. П. ВЕСЕЛКИН

Официальные оппоненты:

доктор медиц. наук, профессор

Н. П. ЕРОФЕЕВ

кандидат медицинский наук

Г.Б. ВАЙНШТЕЙН

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН (Санкт-Петербург)

Защита состоится «10» февраля 2009 г. в «_» часов на заседании кандидатского совета Д 002.127.01 Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан «_» _______ 2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук

М. Н. Маслова

1. Актуальность темы исследования

Дофамин является важнейшим нейромедиатором и нейромодулятором в центральной нервной системе позвоночных животных (Nicola et al., 2000; Carlsson, 2001; Seamans and Yang, 2004), а также гормоном, вырабатываемым мозговым веществом надпочечников и другими тканями (например, почками) (Missale et al., 1998). У млекопитающих и у человека с его участием связывают контроль двигательной активности (Furmidge et al., 1991; Lynch, 1991), эмоций (Weiner et al., 1989; Nieoullon, 2002, 2003; Salqado-Pineda et al., 2005), мышления (Nieoullon, 2002, 2003; Nieoullon and Coquerel, 2003), положительного подкрепления, потребления пищи (Шабанов и соавт., 2000, 2002), эндокринных функций (Missale et al., 1998). Кроме того, дофамин участвует в патогенезе и этиологии некоторых нейрологических и психиатрических заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона, синдром Туретта, (Meltzer, 1980), шизофрения (Snyder et al., 1974), анорексический невроз (Barry and Klawans, 1976), гиперреактивное дефективное расстройство у детей, лекарственная зависимость к кокаину и амфетаминам (Greengerd et al., 1999).

Дофамин и дофамин-иммунореактивные клетки показаны в спинном мозге и гипоталамусе у представителей разных классов позвоночных животных, включая млекопитающих, рептилий, амфибий и рыб (McGeer and McGeer, 1962; Commissiong and Sedgwick, 1974, 1975; Commissiong and Neff, 1979; Константинова, 1979; Bennis et al., 1990; Roberts et al., 1989).

В немногочисленных исследованиях на круглоротых было показано модулирующее действие дофамина на спинальные нейроны миноги (Kemnitz, 1997), и модулирующее действие дофамина на Са²⁺-токи нейронов спинного мозга (Wikstrom et al., 1999). В то же время исследование роли дофамина в механизмах регуляции межнейронного взаимодействия на самых ранних этапах филогенеза позвоночных представляет существенный интерес в плане изучения становления его роли. Принимая во внимание тот факт, что эффекты дофамина исследуются в основном в неостриатуме и прилежащем ядре млекопитающих, о механизмах модулирующего действия дофамина на нейроны спинного мозга позвоночных известно немного. Исследование функциональной роли дофамина в спинном мозгу личинки миноги может выявить особенности становления его роли в онтогенезе, а также позволит получить сведения о формировании механизмов регуляции двигательной активности.

Мультиполярные нейроны спинного мозга пескоройки, являющиеся в функциональном отношении в основном мотонейронами и интернейронами, участвуют во всех функциях спинного мозга. Изучение модулирующего действия дофамина на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи на мембранах мультиполярных нейронов является адекватным подходом в плане изучения формирования функций дофамина в онтогенезе у низших позвоночных.

Таким образом, учитывая все вышесказанное, мы поставили ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ исследование механизмов модулирующего действия дофамина на потенциал-активируемые Na⁺ и К⁺-токи, а также на хемоуправляемые токи, вызванные ГАМК и глицином, на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки.

Для достижения указанной выше цели были поставлены следующие ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАДАЧИ:

1) Исследовать потенциал-активируемые Na⁺ и К⁺-токи, а также ГАМК- и глицин-активируемые токи на мембранах изолированных мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки.

2) Исследовать влияние агонистов и антагонистов дофаминовых рецепторов на потенциал-активируемые Na⁺ и К⁺-токи, а также на хемоуправляемые токи, вызванные ГАМК и глицином.

3) Получить данные о механизмах модуляции дофамином потенциал-активируемые Na⁺ и К⁺-токов, а также ГАМК- и глицин-активируемых токов на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ. На изолированных мультиполярных нейронах спинного мозга пескоройки были впервые исследованы кинетические и фармакологические свойства потенциал-активируемых Na⁺ и К⁺-токов, а также хемоуправляемых токов, вызванных ГАМК и глицином. Впервые было высказано предположение о наличии на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки гетерогенных дофаминовых рецепторов. Результаты исследований показали, что дофамин не изменяет порог активации потенциал-активируемого натриевого тока и сопротивление клеточной мембраны мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки. Впервые было показано, что агонисты Д1 и Д2-рецепторов на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки уменьшают амплитуду потенциал-активируемых Na⁺ и К⁺-токов, и ГАМК- и глицин-активируемых токов, а агонисты Д3-рецепторов -- увеличивают амплитуду потенциал-активируемых Na⁺ и К⁺-токов, и ГАМК- и глицин-активируемых токов. Частичная блокада антагонистом Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 действия агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 была показана при изучении потенциал-активируемых Na⁺-токов. Также было показано, что антагонист Д2-рецепторов - сульпирид полностью блокирует эффекты агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 на потенциал-активируемых Na⁺ и К⁺-токах и полностью блокирует эффекты дофамина на потенциал-активируемых К⁺ токах. Феномен частичной блокады антагонистом Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 эффектов, вызванных дофамином и агонистом Д2-рецепторов квинпиролом, нами был получен при изучении эффектов дофамина на ГАМК- и глицин-активируемые токи. Таким образом, были впервые получены данные о модулирующем действии дофамина на потенциал-активируемые Na⁺ и К⁺-токи и хемоуправляемые токи, вызванные ГАМК и глицином на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

Дофамин оказывает модулирующее действие на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи на мембране мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки.

Модуляция дофамином потенциал-активируемых и хемоуправляемых токов осуществляется за счет разных подтипов дофаминовых рецепторов, которые в разном количественном соотношении экспрессируются на мембране мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования представляют интерес для общей нейрофизиологии, нейробиологии, физиологии нервной клетки и медицины. Они вносят вклад в понимание механизмов модулирующего действия дофамина на потенциал-активируемые Na⁺ и К⁺-токи, а также на хемоуправляемые токи, вызванные ГАМК и глицином, на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки и расширяют уже имеющиеся представления о механизмах модуляции дофамином Na^+, К⁺ и ГАМК-активируемых токов в центральной нервной системе позвоночных. Механизмы модуляции дофамином глицин-активируемых токов на нейронах спинного мозга были изучены впервые. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания осуществления актов движения у круглоротых. Результаты настоящей работы могут быть использованы для дополнения и уточнения уже имеющихся данных о модулирующем действии дофамина у позвоночных животных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих научных собраниях: на Седьмой Всероссийской медико-биологическая конференция молодых исследователей (С-Петербург, 18 апреля 2004); на XIII Международном совещании по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика Л.А. Орбели (Санкт-Петербург, 2006 г.); на ХХ Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 4-8 июня 2007).

ПУБЛИКАЦИИ. Основные результаты диссертации отражены в пяти публикациях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ: Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 3 таблицами. Библиография включает 237 наименований.

2. Методика и объект исследования

В качестве модельного препарата в настоящем исследовании использовался спинной мозг пескоройки - личинки миноги Lampetra planeri. Эксперименты выполнены на отдельных мультиполярных нейронах спинного мозга пескоройки, изолированных ферментативно-механическим способом. Для опытов отбирали крупные особи размером 15-18 см. До использования в эксперименте животные содержались в больших резервуарах с аэрированной водой при температуре зимой не выше 0-4 ^оС, летом -- не выше 18-20^оС.

МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ МОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ДОФАМИНА НА ПОТЕНЦИАЛ-АКТИВИРУЕМЫЕ И ХЕМОУПРАВЛЯЕМЫЕ ТОКИ МУЛЬТИПОЛЯРНЫХ НЕЙРОНОВ СПИННОГО МОЗГА ПЕСКОРОЙКИ.

Изоляцию клеток осуществляли ферментативно-механическим способом, который включал в себя обработку изолированных фрагментов протеолитическим ферментами (1) и последующую механическую диссоциацию ткани путем пипетирования через пипетки Пастера (2).

1) Ферментативная обработка мозга проводилась в два этапа. На первом этапе фрагменты изолированного мозга, длиной около 1 см, инкубировались в течение 20 мин. в растворе с коллагеназой (1.6 мг/мл, Collagenase Type IA, Sigma, USA, раствор для коллагеназы № 3), после чего (второй этап) снимали мягкую мозговую оболочку, изготавливали фронтальные срезы толщиной 1.5 мм и помещали их на 1 час 15 мин. в раствор с проназой (0.5 мг/мл, Pronase E, Sigma, USA, раствор для проназы № 4). После ферментативной обработки срезы мозга промывались в четырех сменах физиологического раствора № 1 (10 мл) с добавлением 0.03 мг/10мл стрихнина по 10, 5, 5 и 10 мин. В первый промывочный раствор добавляли бычий сывороточный альбумин (8мг/10мл); (BSA, Sigma, USA.). Инкубирование проводились в условиях помешивания на шейкере при постоянной аэрации растворов смесью 98 % O₂+2 % CO₂; температура поддерживалась на уровне 18-20^оС.

2) Механическую диссоциацию спинномозговой ткани осуществляли путем многократного пропускания срезов через пипетки Пастера с диаметром кончиков от 150 мкм до 600 мкм. Через 10-15 минут мозг полностью распадался на отдельные клетки, и клетки переносили в экспериментальную камеру для проведения электрофизиологических тестов.

Экспериментальная камера состояла из одного отсека, в котором производили выбор клетки для тестирования и путем приложения отрицательного давления в пипетке добивались контакта внутрипипеточного раствора с цитоплазмой клетки (конфигурация «целая клетка»).

Изготовление пипеток. Для обеспечения контакта с клеткой применялись микропипетки, изготовленные из микрогематокритных капилярных трубок (Fischer Sci. brand, USA). Пипетки вытягивались в две стадии на кузнице МЭ-3 (Киев, Украина) в модификации Батуевой И. В. Кончик пипетки оплавляли, после чего его внутренний диаметр составлял 1.5-2.5 мкм. Оплавленные микропипетки покрывались изоляционным воском, заполнялись пипеточным раствором, приведенным в табл. № 1, и закреплялись в держателе установки. Держатель, в свою очередь, крепился на микроманипуляторе, с помощью которого кончик пипетки подводился к клетке в экспериментальной камере.

Регистрация токов. Токи регистрировались монополярно относительно индифферентного электрода в условиях фиксации потенциала на целой клетке (метод пэтч-кламп в конфигурации «whole-cell» - «целая клетка»). Емкостной ток и ток утечки компенсировали с помощью метода, описанного в литературе (Сигворс и соавт., 1987). В работе был использован усилитель AXOPATCH-1D с головкой CV 4 (Axon Instruments, USA). Во входной головке применялось сопротивление обратной связи 5 ГОм. Регистрируемые токи оцифровывались аналого-цифровым преобразователем DigiData-1200 (Axon Instruments, USA) и сохранялись на твердом диске компьютера (IBM PC-486, USA) программой CLAMPEX пакета pCLAMP 6.2. Высокочастотные шумы до ввода в ЭВМ удалялись фильтром Бесселя второго порядка с полосой пропускания 3 кГц. Программа CLAMPEX позволяет фиксировать потенциал или ток на мембране на заданном уровне и смещать их в соответствии с задачей эксперимента. Анализ данных проводился программой CLAMPFIT 6.2, CLAMРFIT 8.1, Microsoft Excel, Sigma Plot. Документальная запись осуществлялась струйным принтером DeskJet 500C (Hewlett Packard, USA).

Растворы, используемые в экспериментах. Растворы, использованные в экспериментах, представлены в табл. № 1. Каждый раствор использовался согласно задачам конкретного эксперимента. Смена суперфузирующих растворов в экспериментальной камере осуществлялась путем переключения протока.