При изучение модулирующего действия дофамина (5 мкМ) на амплитуду глицин-активируемого тока (0.2 мМ) было показано, что дофамин на разных клетках уменьшает на 36.1±10.1% (n=9, p<0.01) амплитуду глицин-активируемого тока и увеличивает его на 31.4±7.5% (n=6, p<0.01). В контрольных тестах, когда вместо дофамина подавали физиологический раствор, подобные эффекты не наблюдали: уменьшение амплитуды глицин-активируемого тока составило, в среднем, 1.5±0.43% (n=6, р=0.02), а увеличение -- 1.56±0.6% (n=11, р=0.03). Простое взвешенное отклонение или размах вариации при действии дофамина (5 мкМ) на амплитуду глицин-активируемого тока (0.2 мМ) составил 3.0±0.5%, а в контроле (при действии физиологического раствора на амплитуду глицин-активируемого тока) -- 0.0±0.2%.
Действие квинпирола (5 мкМ) -- агониста Д2-рецепторов тоже оказалось на разных клетках разнонаправленным: наблюдалось как уменьшение амплитуды глицин-активируемого тока (0.2 мМ) на 31.2±6.8% (0.2 мМ, n=10, p<0.01), так и увеличение амплитуды глицин-активируемого тока (0.2 мМ) на 25.0±1.4% (n=6, p<0.01). При аппликации (+)-SKF-38393 (5 мкМ) -- агониста Д1-рецепторов амплитуда глицин-активируемого тока (0.2 мМ) только уменьшалась - в среднем на 39.4±14.9% (n=6, p<0.01).
При исследовании действия сульпирида (5 мкМ) - антагониста Д2-рецепторов на эффект дофамина (5 мкМ) на амплитуду глицин-активируемого тока (0.2 мМ), было показано, что эффекты дофамина не блокируются антагонистом Д2-рецепторов сульпиридом: амплитуда глицин-активируемого тока уменьшалась в результате инкубации в растворе с дофамином и с сульпиридом на 31.8±8.8% % (n=7, p<0.002) и увеличивалась на 33.1±6.4% % (n=5, p<0.008). (Для сравнения, дофамин уменьшал амплитуду глицин-активируемого тока на 36.1±10.1% и увеличивал на 31.4±7.5%).
Эффект дофамина (5 мкМ) был заблокирован антагонистом Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 (5 мкМ) (при учете, что эффекты дофамина на глицин-активируемые токи были приняты за сто процентов) на 78.0±1.7% в случае уменьшения амплитуды глицин-активируемых токов (n=7, p<0.01) и на 72.2±3.4% в случае увеличения амплитуды глицин-активируемых токов (n=5, p<0.01).
Антагонист Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 (5 мкМ) блокирует эффекты агониста Д2-рецепторов квинпирола (5 мкМ) (при учете, что эффекты квинпирола на глицин-активируемые токи были приняты за сто процентов) на 72.0±0.2% в случае уменьшения (n=9, p<0.01) и на 70.0±10.3% амплитуды в случае увеличения амплитуды глицин-активируемых токов (n=6, p<0.01).
Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что дофамин оказывает действие на потенциал-активируемые Na+ и K+-токи, и хемоуправляемые токи, вызванные ГАМК и глицином, на мембране мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки. Это действие дофамина относится к модулирующему, так как в данном случае дофамин не вызывал каких-либо постсинаптических токов, а изменял функциональное состояние натриевых, калиевых и хлорных каналов.
Было показано, что эффект дофамина на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи нельзя классифицировать просто как активирующий или ингибирующий, поскольку аппликация дофамина вызывала сложный комплексный эффект. В одних случаях этот эффект выражался в увеличении, а в других в уменьшении амплитуды изученных токов. В целом подобный результат хорошо согласуется с результатами других исследователей (Nicola et al., 2000). В частности, было показано неоднозначное действие дофамина на спайковую активность спинного мозга миноги (Kemnitz, 1997), клеток стриатума крыс (Calabresi et al., 1987; Cereda et al., 1995; Schiffmann et al., 1995).
Известно, что действие дофамина основано на активации двух основных классов дофаминовых рецепторов - Д1 и Д2 (Missale et al., 1998). Активация одного класса рецепторов приводит к уменьшению амплитуды тока, активация другого - к увеличению амплитуды тока (Nicola et al., 2000). Известно также, что дофаминовые Д1 и Д2 рецепторы колокализуются на мембране нейрона (Aizman et al., 2000; Fellous and Suri, 2002) и эффект дофамина зависит от их количественного распределения на мембране (Ding and Perkel, 2002). Поскольку действие дофамина выражалось как в уменьшении, так и в увеличении амплитуды изученных токов, а в отсутствие дофамина подобных изменений не наблюдалось и амплитуда оставалась стационарной то, можно предположить, что действие дофамина является суммой противоположно-направленных эффектов, вызываемых активацией различных классов дофаминовых рецепторов. Для проверки этого предположения был проведен более детальный фармакологический анализ с применением специфических агонистов и антагонистов различных семейств дофаминовых рецепторов.
При исследовании действия специфического агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 было показано, что амплитуда исследуемых токов уменьшалась. Этот результат соответствует данным литературы. В частности, уменьшение пиковой амплитуды Na+ токов при активации дофаминовых рецепторов группы Д1 было получено на изолированных нейронах гиппокампа крыс. Было показано, что этот феномен связан с тем, что активация Д1-рецепторов приводит к фосфорилированию альфа субъединиц натриевых каналов и это происходит с участием протеинкиназы А (Cantrell et al., 1997; Cantrell et al., 1999; 1999). Уменьшение амплитуды Na+ -токов при действии агонистов Д1-рецепторов на срезах неостриатума и добавочных ядер крыс было показано и в других работах (Nicola et al., 2000; Surmeier et al., 1992; Surmeier and Kitai, 1993; Maurice et al., 2001). В шипиковых нейронах стриатума крыс (пэтч-кламп, срезы) активация Д1-рецепторов агонистом Д1-рецепторов приводит к уменьшению потенциал-независимых К+-токов утечки и К+-тока входящего выпрямления через увеличение входного сопротивления и деполяризацию синаптического входа в нейроны (Kitai and Surmeier, 1996; Gorelova et al., 2002). Активация Д1-рецепторов уменьшает амплитуду ГАМКА-активируемых токов в изолированных нейронах неостриатума крыс через РКА/DARPP-32/PP1 (протеин киназа А/дофамин и циклический аденозин 3', 5'-монофосфат-регулирующий фосфопротеин, 32 кД/протеин фосфатаза-1) сигнальный каскад (Flores-Hernandez et al., 2000).
Действие квинпирола -- агониста Д2-рецепторов на амплитуду исследуемых токов оказалось неоднозначным: в одних случаях оно выражалось в уменьшении амплитуды токов, в других - в увеличении амплитуды. Динг и Персел показали (Ding and Percel, 2002), что активация Д2-рецепторов квинпиролом приводила и к уменьшению Na+ токов, и к увеличению Na+ токов в базальных ганглиях птиц. Сурмейер и соавт. (Surmeier et al., 1992) описали такой же эффект в стриатуме крыс. Подобный феномен был обьяснен тем, квинпирол активирует рецепторы Д2-класса: Д2 и Д3-рецепторы, являющиеся разными подтипами Д2-рецепторов (Missale et al., 1998). Активация Д2-рецепторов квинпиролом приводит к уменьшению Na+ токов, а активация Д3-рецепторов квинпиролом приводит к увеличению Na+ токов (Ding and Percel, 2002). Активация Д2-рецепторов приводит и к уменьшению и к увеличению амплитуды К+-токов входящего выпрямления через торможение аденилатциклазы и протеинкиназы А (Nicola et al., 2000). Активация Д2-рецепторов уменьшает амплитуду ГАМКА-активируемых токов в пирамидных нейронах крыс (Delgado et al., 2000; Seamans et al., 2001).
Таким образом, сопоставление полученных результатов с данными литературы дает возможность предположить, что на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки присутствуют как минимум три типа дофаминовых рецепторов. Первый тип - рецептор из класса Д1, активация которого уменьшает амплитуду изученных токов и два других типа рецепторов - из класса Д2 (Д2 и Д3), активация которых приводит к уменьшению (Д2) или к увеличению (Д3) амплитуды изученных токов. Для более обоснованного вывода относительно типов рецепторов, представленных на мембранах исследуемых нейронов был проведен дальнейший фармакологический анализ с применением специфических антагонистов.
Этот анализ показал, что антагонист рецепторов группы Д2 - сульпирид, полностью блокирует эффекты не только квинпирола -- агониста Д2-рецепторов, но и (+)-SKF-38393 -- агониста Д1-рецепторов на амплитуду потенциал-активируемых Na+ и К+-токов. Действие дофамина полностью блокировалось сульпиридом при изучении действия дофамина на амплитуду потенциал-активируемых К+-токов. Похожие данные были приведены у других исследователей. В частности, Грин и соавт. (Green et al., 1996) показали, что у брюхоногих моллюсков при исследовании изолированных париетальных нейронов методом пэтч-кламп антагонист Д2-рецепторов сульпирид блокирует ионные токи, вызванные аппликацией дофамина. Подобное действие объяснялось авторами данной работы тем, что у брюхоногих моллюсков имеются дофаминовые рецепторы отличные от таковых у высших позвоночных животных.
В наших исследованиях антагонист рецепторов группы Д1 - (+)-SCH-23390, частично блокирует эффекты, вызванные активацией рецепторов Д1 - (+)-SKF-38393, но не блокирует изменения амплитуды потенциал-активируемых Na+-токов, вызванные активацией рецепторов Д2 -квинпиролом. Учитывая, что (+)-SKF-38393 (агонист Д1-рецепторов) может активировать как Д1, так и Д5 тип дофаминовых рецепторов, относящихся к одному Д1 классу дофаминовых рецепторов (Missale et al., 1998), мы можем предположить, что отсутствие полной блокады антагонистом Д1-(+)-SCH-23390 действия агониста Д1-рецепторов объясняется специфической химической чувствительностью Д1 и Д5 дофаминовых рецепторов к действию антагонистов у пескоройки или специфику дофаминовых рецепторов этого животного.
При сравнении полученных данных с данными литературы оказалось, что у высших позвоночных антагонисты одного дофаминового класса рецепторов (Д1 или Д2) в большинстве случаев блокируют эффекты агонистов этого же класса дофаминовых рецепторов и не влияют на активацию рецепторов другого класса дофаминовых рецепторов (Surmeier et al., 1992; Ibaсez-Sandoval et al., 2006). В тоже время имеются данные, что на срезах неостриатума крыс in vivo антагонист Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 блокирует эффекты, вызванные агонистом Д2-рецепторов (уменьшение калий-зависимого высвобождения ацетилхолина), и эффекты, вызванные Д1-агонистом (увеличение высвобождения цАМФ) (Plantje et al., 1984; 1984). Таким образом оказалось, что как и в этих исследованиях на высших позвоночных животных у миноги (пескоройки) антагонист Д1-рецепторов SCH-23390 блокирует эффекты, вызванные не только агонистом Д1-рецепторов, но и Д2-рецепторов на ГАМК и глицин-активируемых токах.
При изучении влияния антагонистов на действие агонистов дофамина на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи нами были получены отличные друг от друга данные. В частности, при изучении действия дофамина на потенциал-активируемые токи было показано, что эффекты, вызванные агонистами блокируются антагонистом Д2-рецепторов, а при изучении действия дофамина на хемоуправляемые токи -- антагонистом Д1-рецепторов. Подобное расхождение может быть обьяснено тем, что при действии дофамина на хемоуправляемые токи показан другой возможный путь реализации данных процессов, в частности было показано прямое протеин-протеиновое быстрое связывание и функциональное взаимодействие между дофаминовыми и ГАМКА-рецепторами (Д5- ГАМКА) Лиу и соавт. (Liu et al., 2000). Таким образом, можно предположить, что различие в механизмах, через которые опосредуется вышеописанные процессы приводит к разным результатам при изучении действия антагонистов на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи.
Таким образом, наши исследования свидетельствуют, что катехоламины, в частности дофамин, выполняют модулирующую функцию у представителей позвоночных, находящихся на низшей ступени эволюционного древа. нейрон мозг пескоройка дофамин
Выводы:
1) Дофамин вызывает индивидуальное и разнонаправленное действие в разных нейронах спинного мозга пескоройки.
2) Фармакологический анализ с использованием специфических агонистов и антагонистов дофаминовых рецепторов показал, что в модуляции дофамином потенциал-активируемых и хемоуправляемых токов участвуют разные подтипы дофаминовых рецепторов - Д1, Д5, Д2 и Д3-рецепторы.
3) Направленность модулирующего действия дофамина на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи может определяться преобладанием определенного подтипа дофаминовых рецепторов на мембране данного нейрона.
4) Полученные данные указывают на отличия фармакологической чувствительности дофаминовых рецепторов пескоройки по сравнению с дофаминовыми рецепторами млекопитающих (высших позвоночных).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Букинич А.А. Модулирующее действие дофамина на Na+ -K+ токи дорсальных чувствительных и мультиполярных клеток спинного мозга пескоройки, Мат. Седьмой Всероссийской медико-биологическая конференции молодых исследователей. С-Петербург, Россия, 18 апреля 2004, с. 41.
2. Букинич А.А., Цветков Е. А., Веселкин Н. П. Особенности дофаминовых рецепторов мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки, Сб. тезисов ХIII Межд. совещ. по эвол. физиологии. С-Петербург, Россия, 2006, с. 37-38.
3. Букинич А.А., Цветков Е. А., Веселкин Н. П. Особенности дофаминовых рецепторов на мембране мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки, Ж. эвол. биох. и физиол. 2007. Т. 43, № 1, С. 39-45.
4. Букинич А. А., Веселкин Н. П. Антагонист Д2-рецепторов блокирует эффект дофамина на мембранах мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки, Журнал эволюц. биохимии и физиологии. 2007. Т. 43. № 2. С. 206-209.
5. Букинич А.А., Цветков Е. А., Веселкин Н. П. Модулирующее действие дофамина на амплитуду токов, вызванных ГАМК и глицином, мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки, Сб. тезисов ХХ Съезда физиологического Общества, Москва, Россия, 2007, 4-8 июня, С. 163.