Автореферат: Модулирующее действие дофамина на потенциал-активируемые и хемоуправляемые токи мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки

Средние величины параметров, представленных в главе "Результаты и их обсуждение", приведены со средней квадратичной ошибкой и расчитывались по общепринятой методике, описанной в литературе (Лакин, 1980). Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента.

Таблица № 1. Растворы, используемые в опытах на изолированных клетках.

Сокращения: ЭГТА - Этиленгликоль тетрауксусная кислота; ТЭА - тетраэтиламмоний.

Использованные растворы:

Физ. р-р № 1 - физиологический раствор для изолированных клеток;

препар. р-р № 2 - раствор для препаровки спинного мозга;

р-р для коллагеназы № 3 - раствор для ферментативной обработки мозга после добавления коллагеназы;

р-р для проназы № 4 - раствор для ферментативной обработки мозга после добавления проназы; пипеточный раствор № 5.

Исследование основных свойств потенциал-активируемых и хемоуправляемых токов, вызванных ГАМК и глицином, изолированных мультиполярных нейронов методом пэтч-кламп.

Исследование трансмембранных ионных токов мультиполярных нейронов проводили в режиме фиксации мембранного потенциала (МП) на целой клетке. Диапазон МП находился в пределах от -120 до 30 мВ. В большинстве тестов данной экспериментальной серии МП мультиполярных нейронов поддерживали на уровне -100 мВ. Выбор этого значения был определен двумя причинами. Во-первых, при таком уровне МП удается снизить до минимума инактивацию потенциал-зависимых каналов мембраны. Во-вторых, амплитуда исследуемых токов при данном значении МП была оптимальна.

Проведенные тесты показали, что при фиксации мембранного потенциала (МП) на уровне -100 мВ поляризация мембраны от -120 до 30 мВ импульсом тока длительностью 50 - 100 мс вызывала появление интегрального трансмембранного тока, который помимо емкостного тока и тока утечки включал в себя ионный компонент, состоящий из Na⁺ и К⁺-тока (n=32). Сопротивление клеточной мембраны мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки составило 124.58 21.36 МОм (n=32), среднее значение емкости мембраны - 302 34 пФ (n=10).

Характеристики Na⁺-тока исследовались в условиях блокады калиевого тока тетраэтиламмонием (ТЭА) (физиологический раствор № 1 с добавлением от 15 до 45 мМ ТЭА). Было показано, что этот ток однороден и полностью блокируется 1 мкМ тетродотоксином (ТТХ). При стимуляции клетки импульсами длительностью 50 - 100 мс, последовательно поляризующим мембрану потенциалами от -120 до 30 мВ, входящий натриевый ток возникал и был максимальным при подаваемом потенциале около -50 мВ, и далее при увеличении потенциала амплитуда тока уменьшалась.

К⁺-ток исследовался в условиях блокады натриевой проводимости ТТХ (физиологический раствор № 1 с добавлением 1мкМ ТТХ). Этот ток активировался при потенциале около -50 мВ и далее линейно возрастал пропорционально МП. В условиях ТТХ-блока выходящий ток достигал своего максимального значения за 5-10 мсек и по достижении своего пикового значения удерживался на плато в течение 50 мс и более, не обнаруживая отчетливой инактивации. Длительность фазы нарастания тока зависела от уровня деполяризации мембраны.

При исследовании хемоуправляемых токов, вызванных ГАМК (n=32) и глицином (n=35) было показано, что амплитуда и полуширина токов насыщения при фиксации потенциала на -100 мВ составили в среднем 2.17±0.45 нА и 742±110 мсек для ГАМК, и 5.09±0.42 нА и 525±114 мсек для глицина. Потенциал реверсии, вычисленный согласно соотношению: V_rev= -b/a, составил -35 мВ для ГАМК- и -30 мВ для глицин-активируемых токов. Полученные значения близки к потенциалу реверсии хлорного тока, вычисленному по уравнению Нернста для используемых в тестах концентраций ионов хлора (-37.0. мВ, исходя из внеклеточной и внутрипипеточной концентрации ионов Сl^-, равных соответственно 133 и 30 мМ). Последнее свидетельствует в пользу того, что токи, вызываемые аппликацией ГАМК и глицина, связаны с активацией хлорной проводимости.

Исследование влияния дофамина, агонистов и антагонистов Д1 и Д2-рецепторов на потенциал-активируемые Na⁺ и K⁺-токи, и хемоуправляемые токи, вызванные ГАМК и глицином, изолированных мультиполярных нейронов спинного мозга пескороек.

При аппликации 10 мкМ дофамина (n=29) в условиях фиксации потенциала на уровне -100 мВ было установлено, что дофамин не вызывает изменений порога активации потенциал-активируемого натриевого тока: при регистрации натриевых токов в физиологическом растворе этот параметр составил, в среднем, -52±14.76 мВ, при действии дофамина - 53±15.67 мВ.

В этой же серии экспериментов регистрировали и сопротивление клеточной мембраны исследуемых нейронов. В нормальном физиологическом растворе этот параметр составил в среднем 124.58±21.36 МОм. При аппликации 10 мкМ дофамина сопротивление клеточной мембраны не измененялось и составило в среднем 124.49±21.35 МОм.

Однако было показано, что дофамин (10 мкМ) статистически достоверно увеличивал в среднем на 8.6±6.1% (n=5), и уменьшал, в среднем, 13.5±2.2% (n=24) пиковую амплитуду натриевого тока на разных клетках. В контрольный серии экспериментов, когда вместо дофамина подавали физиологический раствор, подобные эффекты не наблюдали: уменьшение амплитуды Na⁺-тока составило, в среднем, 0.17±0.06% (n=9, р=0.04), а увеличение -- 0.42±0.14% (n=6, р=0.02). Сопоставление величин изменения пиковой амплитуды натриевого тока при действии дофамина и в контрольной серии экспериментов позволяет нам делать вывод о наличии эффектов дофамина на пиковую амплитуду натриевого тока. Тот факт, что, дофамин действует на пиковую амплитуду натриевого тока, был доказан и при сравнении размаха вариации. Простое взвешенное отклонение или размах вариации при действии дофамина на амплитуду потенциал-активируемых Na⁺-токов составил 9.9±2.5%, а в контроле (при действии физиологического раствора на амплитуду потенциал-активируемых Na⁺-токов) -- 0.2±0.5%.

Для исследования механизма действия дофамина была проведена серия экспериментов с применением специфических агонистов Д1 и Д2-рецепторов. Тесты показали, что специфический агонист Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 (10 мкМ) уменьшал пиковую амплитуду Na⁺-тока в среднем на 31.1±10.6% (n=5; p<0.01), в то время как специфический агонист Д2-рецепторов квинпирол (10 мкМ) одних случаях уменьшал амплитуду Na⁺-тока, в среднем, на 13.2±3.1% (n=4; р<0.01), а в других - увеличивал в среднем на 30.7±17.0% (n=4; р<0.01) на разных клетках.

Применение специфических антагонистов Д1 и Д2-рецепторов (при изучении Na⁺-токов) показало, что антагонист Д2-рецепторов сульпирид (10 мкМ) полностью блокирует как эффекты агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 (10 мкМ) (n=6, p>0.05), так и агониста Д2-рецепторов квинпирола (10 мкМ) (n=5, p>0.05). Эффект агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 (10 мкМ) на амплитуду Na⁺-тока был заблокирован антагонистом Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 (10мкМ) (при учете, что эффект (+)-SKF-38393 на амплитуду Na⁺-тока был принят за сто процентов) на 58.5±12.7% (n=6, p<0.01). Эффект агониста Д2-рецепторов квинпирола (10 мкМ) (уменьшение амплитуды Na⁺-тока) не был заблокирован антагонистом Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 (10 мкМ) (n=5, p<0.01).

В результате экспериментов было показано, что при аппликации агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 (10 мкМ) происходит уменьшение амплитуды К⁺-токов в среднем на 14.3±4.3% (n=6, p<0.01). Агонист Д2-рецепторов квинпирол (10 мкМ) уменьшал амплитуду К⁺токов, в среднем,на 5.5±2.5%, (n=6, p<0.01), и увеличивал амплитуду К⁺токов в среднем на 13.2±3.0% (n=6, p<0.01) на разных клетках. В контрольных тестах, когда вместо квинпирола подавали физиологический раствор, подобные эффекты не наблюдали: уменьшение амплитуды К⁺-тока составило, в среднем, 0.49±0.07% (n=15, р=0.003), а увеличение -- 0.65±0.19% (n=7, р=0.01). Простое взвешенное отклонение или размах вариации при действии квинпирола на амплитуду потенциал-активируемых К⁺-токов составил 8.4±1.0%, а в контроле при регистрации в физиологическом растворе на амплитуду потенциал-активируемых К⁺-токов -- 0.1±0.6%. Таким образом, доказано, что квинпирол оказывает действие на амплитуду потенциал-активируемых К⁺-токов.

Применение специфических антагонистов Д1 и Д2-рецепторов (при изучении К⁺-токов) показало, что антагонист Д2-рецепторов сульпирид (10 мкМ) полностью блокирует как эффекты агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 (10 мкМ) (n=5, p=0.2), так и агониста Д2-рецепторов квинпирола (10 мкМ) (n=5, p>0.05). Антагонист Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 (10 мкМ) на эффект, вызванный агонистом Д2-рецепторов квинпиролом (10 мкМ) (уменьшение амплитуды К⁺-тока) никакого действия не оказал (n=7, p<0.01), и не заблокировал действие агониста Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 (10 мкМ) на амплитуду К⁺-тока (n=11, p<0.01). Эффекты дофамина (10 мкМ) на амплитуду К⁺-тока были полностью заблокированы антагонистом Д2-рецепторов сульпиридом (10 мкМ) (n=6, p>0.05).

Изучение модулирующего действия дофамина было продолжено на хемоуправляемых токах, вызванных ГАМК и глицином, на мембране мультиполярных нейронов спинного мозга пескоройки.

Тесты показали, что аппликация дофамина (5 мкМ) уменьшает амплитуду ГАМК-активируемого тока (2 мМ), в среднем, на 33.3±8.7% (n=8, p<0.01), и увеличивает амплитуду, в среднем, на 37.3±11.8% (n=5, p<0.01) на разных клетках. В контрольных тестах, когда вместо дофамина подавали физиологический раствор, подобные эффекты не наблюдали: уменьшение амплитуды ГАМК-активируемого тока (2 мМ) составило, в среднем, 4.44±1.91% (n=9, р=0.04), а увеличение -- 4.24±1.39% (n=8, р=0.02). Простое взвешенное отклонение или размах вариации при действии дофамина (5 мкМ) на амплитуду ГАМК-активируемого тока (2 мМ) составил 10.0±4.2%, а в контроле (при действии физиологического раствора на амплитуду ГАМК-активируемого тока (2 мМ)) -- 0.01±0.6%.

При изучении действия агонистов Д1 и Д2-рецепторов на амплитуду хемоуправляемых токов было показано, что агонист Д1-рецепторов (+)-SKF-38393 (5 мкМ) уменьшает амплитуду ГАМК-активируемого тока (2 мМ), в среднем, на 63.1±11.7% (n=8, p<0.01). Агонист Д2-рецепторов квинпирол (5 мкМ) вызывает в разных клетках эффекты подобные дофамину: увеличение амплитуды ГАМК-активируемого тока на 61.0±13.8% (n=8, p<0.01), и уменьшение амплитуды на 55.7±2.0% (n=6, p<0.01). Концентрация ГАМК составляла 2 мМ.

При исследовании действия антагонистов на эффекты, вызванные дофамином (5 мкМ) на амплитуду ГАМК-активируемых токов (2 мМ) было показано, что антагонист Д2-рецепторов сульпирид (5 мкМ) не блокирует эффекты, вызванные дофамином: уменьшение амплитуды составило 35.0±5.9% (n=6, p<0.01), увеличение амплитуды -- 35.5±13.0% (n=5, p<0.01). (Для сравнения, дофамин вызывал уменьшение амплитуды ГАМК-активируемого тока, в среднем, на 33.3±8.7%, и увеличение амплитуды, в среднем, на 37.3±11.8%.). В тоже время действие дофамина (5мкМ) на ГАМК-активируемые токи было заблокировано антагонистом Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 (5 мкМ) (при учете, что эффекты дофамина на ГАМК-активируемые токи были приняты за сто процентов) на 63.0±4.7% в случае уменьшения амплитуды ГАМК-активируемых токов (n=7, p<0.001) и 77.1±2.0% в случае увеличения амплитуды ГАМК-активируемых токов (n=5, p<0.01). Эффекты агониста Д2-рецепторов квинпирола 5 мкМ на амплитуду ГАМК-активируемых токов были заблокированы антагонистом Д1-рецепторов (+)-SCH-23390 5 мкМ (при учете, что эффекты квинпирола на ГАМК-активируемые токи были приняты за сто процентов) на 78.8±0.4% в случае уменьшения (n=6, p<0.01) и на 85.0±5.7% в случае увеличения амплитуды ГАМК-активируемых токов (n=10, p<0.01).