Экспрессию белков генов р-53 и Bcl-2 определяли методом иммуногистохимического анализа в реакции с вторичными антителами. Индекс апоптоза рассчитывали по отношению числа клеток в состоянии апоптоза к общему количеству клеток в препарате и выражали в процентах (Аrcher C.D., 1998).
Интенсивность реакции на активированные кислородные метаболиты (АКМ) в образцах нативной хрящевой ткани ПР тел позвонков новорожденных поросят, а также поросят в возрасте 7 - 40-а суток оценивали в реакции с нитротеразолиевым синим (Hill K.S., 1978). Дифференциальное определение свободнорадикального оксида азота в хрящевой ткани ПР оценивали по локализации его селективного маркера - фермента NO-синтазы (Mayer B., 1995).
Исследования проводились на базе лаборатории морфологии НГПУ и кафедры свиноводства НГАУ.
Для получения первичной культуры клеток использовали хрящевые тела позвонков плодов человека на сроке 12 недель гестации непосредственно после медицинского аборта от клинически здоровых женщин. Полученную первичную культуру клеток культивировали в концентрации 3х105 кл/мл в среде ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением 20% фетальной сыворотки крови плодов коровы при 370С в течение 4 пассажей на протяжении 12 дней. Каждые 3 дня клетки снимали с подложки смесью трипсина с версеном, четыре равные части центрифугата отбирали для проведения исследований, оставшиеся клетки пересевали. Исследования проводили на базе НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор», НИИ инновационных медицинских технологий НГМУ, лаборатории морфологии НГПУ.
Для морфологических и цитохимических исследований клетки в суспензии и монослое на стекле фиксировали в метиловом спирте. Для получения обзорных препаратов и морфометрии клетки окрашивали гематоксилином и эозином. Распределение гликогена и гликопротеидов изучали посредством ШИК-реакции и проведения контроля с амилазой. Суммарные кислые ГАГ выявляли альциановым синим. Для дифференцированного выявления КС, ХС и гиалуроновой кислоты ставили реакцию с толуидиновым синим при значениях рН раствора красителя 1,5; 2,5 и 5,0. Для иммуноцитохимического определения коллагена II типа ставили реакцию с вторичными антителами (Novocastra Laboratories ltd., UK) к коллагену II типа.
Для проведения ультраструктурного анализа клетки снимали с поверхности монослоя смесью трипсина (0,02%) и версена (0,025%) в соотношении 1:1. Взвесь клеток центрифугировали, осадок фиксировали в 4%-м растворе параформа, дофиксировали 1%-м раствором OsO4, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, пропитывали и заливали в смесь эпон - аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Raichert (Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты изучали в электронном микроскопе Н-600 (Hitachi, Япония). Ультраструктурные исследования проводили на базе отдела микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Все манипуляции в ходе ксенотрансплантации фетальных хондробластов человека в суставной дефект крыс проводили в соответствии с международными принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. У всех крыс - самцов линии Вистар массой 250 граммов в области межмыщелковой ямки дистального эпифиза бедренной кости стоматологическим бором диаметром 2,5 мм производили дефект суставного хряща на глубину до субхондральной кости.
У крыс группы I (15 особей) дефект оставляли свободным; у животных группы II (15 особей) - заполняли хитозановым гелем; у крыс группы III (15 особей) - тканеинженерной конструкцией на основе хитозанового геля и первичной культуры фетальных хондробластов человека второго пассажа в количестве 3х105 клеток. Рану послойно ушивали шелком. В течение двух недель послеоперационного периода один раз в сутки внутримышечно вводили антибиотик линкомицин в дозе 5 мг. На 60-е сутки животных под эфирным наркозом выводили из эксперимента и выделяли фрагменты дистального эпифиза бедренной кости для проведения морфогистохимического анализа. Данный фрагмент исследований проводили на базе лаборатории морфологии НГПУ и НИИ инновационных медицинских технологий НГМУ.
Измерение морфометрических характеристик проводили с помощью комплекса программ AxioVision. Статистическую обработку данных осуществляли по общепринятым методикам с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при р ? 0,05.
2. Результаты исследования и их обсуждение
1. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе
Позвоночный столб человека на сроке 8 недель, а свиньи на сроке 4 недели гестации представлен мезенхимными телами позвонков, разделенными клетками формирующихся межпозвонковых дисков. Мезенхимные клетки имеют уплощенную или полигональную форму. Ядро округлое с большим количеством гетерохроматина. Цитоплазма обильная, умеренно базофильная, содержит пылевидный ШИК-позитивный материал, исчезающий после предварительной обработки срезов амилазой, а также следовые количества суммарных ГАГ. Межклеточное вещество выражено слабо и бледно окрашивается на коллаген по Маллори. Окрашивание толуидиновым синим при значении рН раствора красителя 5,0 позволяет наблюдать слабо выраженную реакцию в цитоплазме и межклеточном веществе на гиалуроновую кислоту. Реакция с толуидиновым синим при рН 1,5 и 2,5 на ХС и КС отрицательна. Рефракция макромолекул несульфатированных ГАГ в поляризованном свете в препаратах позвоночника человека и свиньи в этот период не выявляется.
Хрящевая модель тела позвонка человека на 12-й неделе и свиньи на 6-й неделе гестации представлена мелкими клетками округлой формы, располагающимися в одиночных округлых или овальных лакунах. Слаборазвитый матрикс бледно окашивается на коллаген по Маллори и характеризуется невысоким содержанием кислых ГАГ, которые по данным поляризационно-оптического анализа присутствуют в низкополимерной форме. Полученные результаты позволяют характеризовать эти клетки как низкодифференцированные, для которых характерно мелкое, интенсивно базофильное ядро округлой формы, расположенное в центре клетки, и высокое ядерно-цитоплазматическое отношение (рис. 1 А).
Степень дифференцировки клеток возрастает от периферии хрящевой модели тела позвонка к центру оссификации, что находит свое отражение в увеличении объема хрящевого матрикса и усилении клетками синтеза его компонентов. С повышением степени дифференцировки хондробластов изменяется их морфология. Хондробласты располагаются в овальных лакунах и принимают уплощённую форму. Снижается их ядерно-цитоплазматическое отношение (рис. 1 А), ядро становится овальным или приобретает бобовидную форму, увеличивается коэффициент формы ядра (рис. 1 В). Уплощение ядра и цитоплазмы нарастает ближе к центру оссификации.
Рис. 1. Морфометрические показатели клеток зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель гестации: А - ядерно-цитоплазматическое отношение; В - коэффициент формы ядра; С - содержание низкодифференцированных клеток в хрящевой ткани зоны роста тела позвонка свиньи.
Примечание: различия показателей достоверны (* р ? 0,05; ** р ? 0,01; *** р ? 0,001).
На границе с центром оссификации располагаются наиболее дифференцированные хондробласты, представляющие собой самые крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением (рис. 1 А). Их цитоплазма и территориальный матрикс обильно заполнены сульфатированными ГАГ. Ядро располагается в центре клетки и имеет самый высокий показатель коэффициента формы ядра (рис. 1 В). На срезах, выполненных под углом к сагиттальной плоскости, отчетливо видна дисковидная форма ядра. Уплощенное с двух полюсов округлое ядро при изменении плоскости его расположения в клетке дает картину круга или овала, либо вытянутого профиля.
Полученные морфофункциональные характеристики позволяют использовать в качестве критериев дифференцировки клеток хондрогенного дифферона не только площадь клетки и ядерно-цитоплазматическое отношение, но и предложенный нами новый параметр - коэффициент формы ядра. Эти критерии могут быть использованы для анализа клеточного материала, выделенного из зон роста тел позвонков человека и свиньи при культивировании in vitro с целью последующего использования в тканевой инженерии.
Сравнение формирующихся хрящевых тел позвонков 12-недельного плода человека и 6- недельного плода свиньи выявило различия в развитии переднего и заднего отделов зоны роста (ЗР) у человека, а у свиньи вентрального и дорсального отделов соответственно, обусловленные степенью дифференцировки хондробластов и зрелости матрикса гиалинового хряща. Смещенный к передней (вентральной) продольной связке центр оссификации определяет неравномерное распределение клеток разной степени дифференцировки в теле позвонка. Преобладание в заднем (дорсальном) отделе хрящевого тела позвонка низкодифференцированных хондробластов (рис. 1 С) и слабо выраженный синтез клетками компонентов межклеточного вещества, имеющего достоверно низкий показатель рефракции по сравнению с передним (вентральным) отделом, указывают на отставание в развитии заднего (дорсального) отдела по сравнению с передним (вентральным). Следует отметить, что в переднем (вентральном) отделе тела позвонка отмечается начало формирования колонковых структур, в то время как со стороны заднего (дорсального) отдела клетки не имеют строго определенной векторной направленности. Таким образом, у человека на сроке 12 недель, а свиньи - 6 недель гестации впервые определяется асимметрия в развитии хрящевого тела позвонка, обусловленная расположением в переднем (вентральном) отделе полюса высокой метаболической активности, а в заднем (дорсальном) отделе - полюса низкой активности.
У человека в период от новорожденности до 1 года, а у свиньи - до 8 недель пренатального развития происходит формирование пластинки роста (ПР) тела позвонка. На сагиттальных срезах тело позвонка новорожденного имеет овальную форму и выполнено хрящевой тканью. В центре тела позвонка расположена зона остеогенеза, в которой определяются сосуды и примитивные костные балки с включениями хрящевой ткани. Вокруг зоны остеогенеза располагаются хрящевые клетки, которые формируют зону роста. Следует подчеркнуть, что на данном этапе развития типичное строение, характерное для ПР, отсутствует. Морфологически идентифицируются зоны резервного, пролиферирующего и гипертрофического хряща. Одиночные клетки резервной зоны лежат в овальных лакунах. Крупное округлое ядро занимает практически весь объем цитоплазмы, в которой выявляются мелкие гранулы ШИК-позитивного вещества. При окрашивании толуидиновым синим при рН 5,0 в цитоплазме этих клеток отмечается резко положительная реакция на гиалуроновую кислоту. Межтерриториальный матрикс бледно окрашивается альциановым синим.
Овальные клетки пролиферирующей зоны располагаются попарно или по 3-4 в одной лакуне и формируют изогенные группы. Плоскость их деления не имеет строгой направленности. Цитоплазма и межтерриториальный матрикс бледно окрашиваются на суммарные ГАГ альциановым синим. В цитоплазме выявляются редкие мелкие гранулы ШИК-позитивного вещества. Одиночно лежащие клетки этой зоны имеют округлое ядро, цитоплазма и территориальный матрикс интенсивно окрашиваются альциановым синим. В межтерриториальном матриксе альцианпозитивное вещество выявляется в виде крупных гранул. В зоне гипертрофированного хряща клетки располагаются группами в крупных лакунах округлой или овальной формы и формируют кластеры. Матрикс вокруг лакун неравномерно окрашивается альциановым синим.
Вышеописанные морфофункциональные характеристики свидетельствуют, что процессы пролиферации хондробластов в данный возрастной период опережают созревание хрящевой ткани. Подтверждением невысокой степени дифференцировки клеток является наличие низкополимерных ГАГ в матриксе и особенности морфологии хондробластов. В данный возрастной период рост направлен, прежде всего, на увеличение хрящевой модели тела позвонка, что обусловливает асинхронность пролиферации клеток и их дифференцировки. Отражением процесса увеличения хрящевой модели преимущественно за счет активной пролиферации хондробластов, а не их синтетической активности, является несовершенный остеогенез. Разобщение пролиферации и синтеза клетками специфических для хряща биополимеров может быть связано с отсутствием компрессии как одного из важнейших регуляторов дифференцировки хондробластов.
Следует отметить неравномерное развитие ЗР тела позвонка человека и свиньи в переднем (вентральном) и заднем (дорсальном) отделах. Колонковые структуры начинают формироваться только в переднем (вентральном) отделе ЗР, плоскость расположения хондробластов параллельна продольной оси тела позвонка. Межклеточное вещество хорошо выражено, характеризуется умеренной реакцией на кислые ГАГ. Мелкие альцианпозитивные гранулы равномерно распределены в межтерриториальном матриксе. В заднем (дорсальном) отделе клетки гипертрофического слоя локализуются группами и не имеют строгой векторной направленности. Межклеточное вещество слабо выражено. При реакции на суммарные кислые ГАГ наблюдаются интенсивно альцианпозитивные крупногранулярные структуры. Степень рефракции макромолекул ХС, КС, гиалуроновой кислоты и коллагена в межклеточном веществе переднего отдела ЗР тела позвонка человека превышает соответствующий показатель заднего отдела (табл. 2). Содержание низкодифференцированных клеток в заднем отделе ЗР тела позвонка превышает этот показатель на 22,55 % по сравнению с передним отделом. Указанные признаки могут указывать на замедление дифференцировки клеток в заднем отеле ЗР по сравнению с передним.