Реакция на гликоген и гликопротеины в клетках 2-го и 3-го типов выявила гранулярное интенсивно окрашенное реактивом Шиффа вещество, заполняющее весь объем цитоплазмы. Гранулы ШИК-позитивного вещества в цитоплазме клеток 3-го типа крупнее, чем в клетках 2-го типа. Обработка срезов амилазой значительно снижает интенсивность ШИК-реакции. В цитоплазме клеток 2-го и 3-го типов при окрашивании альциановым синим на кислые ГАГ выявляются крупные гранулы альцианпозитивного вещества, диффузно расположенные в цитоплазме. При реакции с толуидиновым синим на КС в клетках 2-го и 3-го типов по периферии клеток выявляются крупные интенсивно окрашенные в синий цвет гранулы. Крупные гранулы ХС сливаются и заполняют всю цитоплазму.
Ультраструктура основной части клеток 2-го пассажа свидетельствует об активных процессах синтеза белка и его процессинга: ядро содержит большое количество эухроматина и крупное ядрышко; клетки имеют хорошо развитую систему цистерн ЭПР и аппарат Гольджи с большим количеством транспортных везикул. В околоядерной зоне многих клеток накапливаются небольшие секреторные гранулы средней электронной плотности. По сравнению с клетками 1-го пассажа, нарастает степень расширения цистерн ЭПР, переполненных секреторным продуктом. Площадь полей гликогена варьирует в разных клетках, включения гликогена могут занимать до четверти площади цитоплазмы. Часть клеток содержит жировые включения.
Характерной особенностью первичной культуры клеток 2-го пассажа является формирование межклеточного вещества. Между клетками и на поверхности монослоя альциановым синим выявляются кислые ГАГ в виде гомогенного, бесструктурного вещества. Иммунохимическая реакция выявляет присутствие коллагена II типа в межклеточном веществе.
Первичная культура клеток на 3-ем пассаже представлена теми же типами клеток, однако меняется характер её роста: в монослое формируются «острова» плотного роста. Центр «острова» образован плотно прилежащими клетками всех трех типов, а по периферии расположены клетки 3-го типа. Морфометрический анализ выявил дальнейшее снижение содержания клеток 1-го типа (3,11%) и увеличение содержания клеток 3-го типа (37,15%) по сравнению с предыдущим пассажем. Содержание клеток 2-го типа составило 59,74%.
Наблюдаемый на 3-ем пассаже резкий рост числа средне- и высокодифференцированных хондробластов происходит главным образом за счет дифференцировки клеток 1-го и 2-го типов. Высокодифференцированные клетки 3-го типа доминируют. На светооптическом уровне они определяются как самые крупные клетки с большим количеством отростков, обычно расположенные обособленно. Морфологически они представляют собой зрелые, функционально активные клетки. Вероятно, находясь даже не в составе ткани, а в культуре клеток, зрелые хондробласты секретируют продукты специфического синтеза и обособляются друг от друга, реализуя генетическую программу формирования межклеточного матрикса. На препаратах, окрашенных альциановым синим, отчетливо видно, как секретируемые единичные гранулы кислых ГАГ скапливаются на поверхности монослоя, а затем, сливаясь между собой, формируют обильный матрикс.
Ультраструктурное исследование показало, что для высокодифференцированных хондробластов характерны процессы интенсивного синтеза. Их цитоплазма содержит многочисленные профили шероховатого и гладкого ЭПР. Зона комплекса Гольджи расширена, в цитоплазме наблюдается большое количество окаймленных везикул, осуществляющих транспорт макромолекул. Синтезированные белки поступают в цистерны аппарата Гольджи и гликозилируются. В аппарате Гольджи происходит окончательное формирование молекул гликопротеинов и протеогликанов (Russtll J., 2003; Sacher M., 2007). Гиперфункция ЭПР в хондробластах высокой степени дифференцировки отражает синтез специфического белка (коллагена II типа), выявляемого иммунохимически. Таким образом, культура клеток на третьем пассаже характеризуется минимальным содержанием низкодифференцированных хондробластов. Отличительной чертой данного пассажа является то, что монослой на 97% представлен высокоактивными клетками, формирующими хорошо выраженный матрикс хрящевой ткани in vitro.
Культура клеток на 4-ом пассаже формирует плотный монослой, в котором выявляются локусы округлой формы. Клеточная популяция представлена теми же типами клеток, что и на предыдущих пассажах, однако меняется их соотношение - содержание клеток 1-го типа составляет всего 1,12% от общего количества клеток. Отмечается снижение количества клеток 3-го типа до 11,83%. Основную долю клеток на данном пассаже составляют клетки 2-го типа (87,05%). Морфофункциональные характеристики этих клеток аналогичны таковым на предыдущих пассажах и соответствуют хондробластам средней степени дифференцировки.
На 4-ом пассаже не наблюдается обильного матрикса, присущего культуре клеток 3-го пассажа. Популяция клеток 4-го пассажа на ультраструктурном уровне характеризуется преобладанием клеток, содержащих расширенные цистерны ЭПР, секреторные гранулы и лизосомные структуры. В клетках наблюдаются признаки угасания синтетической активности - сокращение площади и количества транспортных везикул, вакуолизация аппарата Гольджи. В цитоплазме появляются электронно-прозрачные участки и вакуоли, отражающие нарушение водно-ионного равновесия, а также многочисленные включения липидов, являющиеся одним из признаков «старения» клеток. Срезы содержат большое количество разрушающихся клеток и клеточный детрит.
Характерным признаком 4-го пассажа является появление округлых локусов, в центре которых локализуются участки гомогенного оксифильного вещества, по периферии - интенсивно базофильный матрикс с клетками. Такие локусы имеют вид «узелков» и отграничены от монослоя мелкими клетками с гиперхромным ядром. Базофильный матрикс на периферии «узелков» и оксифильный матрикс в его центральной части проявляют тинкториальные свойства, схожие с хрящевой тканью in vivo в зоне остеогенеза. Это позволяет предположить, что формирование «узелков» отражает завершающий этап дифференцировки клеток in vitro - их кальцификацию. Процесс кальцификации хряща генетически детерминирован и связан с изменением метаболизма хрящевых клеток, в частности, синтезом ими матриксных везикул, содержащих щелочную фосфатазу.
Проведенное исследование показало, что первичная культура клеток, полученная из хрящевых тел позвонков плодов человека на сроке 12 недель гестации состоит из хондробластов. На 1-ом пассаже культура главным образом представлена низкодифференцированными малоактивными хондробластами. Вероятно, это объясняется тем, что большая часть средне- и высокодифференцированных хондробластов разрушается при выделении из нативного фетального хряща. Далее, от пассажа к пассажу, снижается содержание низкодифференцированных клеток, накапливаются хондробласты, находящиеся на среднем и высоком уровне дифференцировки. На 3-ем пассаже увеличиваются синтез и секреция в культуральную среду основных биополимеров, происходит формирование матрикса, что характерно для клеток зоны созревания в нативной пластинке роста. На 4-ом пассаже в монослое хондробластов формируются «узелки», и этот процесс напоминает оссификацию хрящевого матрикса в зоне энхондрального остеогенеза in vivo.
Согласно современным представлениям о дифференциальной активности генов, можно предположить, что особенности клеточного состава на каждом из пассажей связаны с тем, что в каждом конкретном типе клеток функционирует свойственный только этому типу набор экспрессирующихся генов. Благодаря их функционированию обеспечиваются закономерные пролиферация и дифференцировка хондробластов в динамике пассажей in vitrо, которые, хотя и в упрощенном виде, но все же воспроизводят основные этапы развития хондробластов фетальной пластинки роста in vivo - от момента их образования и до завершения жизненного цикла.
Полученные данные о структурно-функциональных особенностях хондробластов в динамике их культивирования указывают на сохранение клетками специфической морфологии и функций in vitro. Данный факт позволяет говорить не только о возможности использования клеток первичной культуры в качестве донорского материала, но и об использовании первичной культуры фетальных хондробластов в качестве экспериментальной модели для изучения дифференцировки хондробластов фетальной пластинки роста человека, оценки влияния поражающих факторов и эффективности применения лекарственных средств.
Проведенное исследование позволяет сформулировать критерии оптимального выбора клеточного материала с целью использования первичной культуры фетальных хондробластов для создания тканеинженерных конструкций. Клеточная популяция, предназначенная для трансплантации, должна обеспечивать репаративную регенерацию поврежденного хряща, как за счет репродукции клеток, так и синтеза компонентов матрикса. В этом плане наиболее подходящей для создания тканеинженерных конструкций является клеточная популяция хондробластов 2-го пассажа. Это объясняется оптимальным соотношением низко-, средне- и высокодифференцированных клеток. При этом низкодифференцированные клетки с высокой пролиферативной активностью способны заполнить хрящевой дефект, средне- и высокодифференцированные хондробласты - наполнить дефект матриксом. Использование хондробластов первичной культуры 3-го и 4-го пассажей для тканеинженерных конструкций нецелесообразно, поскольку их популяция представлена в основном высокодифференцированными клетками, которые менее резистентны к изменению факторов окружающей среды, более подвержены повреждению и гибели.
4. Морфофункциональная характеристика пост-травматического регенерата суставного хряща крысы при трансплантации фетальных хондробластов человека
Для проверки концепции выбора оптимального клеточного материала для тканевой инженерии в эксперименте на лабораторных животных была проведена ксенотрансплантация первичной культуры фетальных хондробластов человека второго пассажа в дефект суставного хряща дистального эпифиза бедренной кости крыс.
У крыс, не получавших лечебного воздействия, на 60-е сутки после нанесения повреждения макроскопически отчетливо заметен дефект суставного хряща, который имеет овальную форму и располагается в межмыщелковой ямке в виде кратерообразного углубления. На светооптическом уровне четко идентифицируются границы опила суставного хряща и сформировавшийся регенерат. Края опила неровные, покрыты плотной неоформленной волокнистой соединительной тканью. Величина диастаза составляет 3,89±0,35 мм. Следует отметить, что регенерат заполняет не весь дефект и имеет вид конуса, вершина которого выступает за пределы суставной поверхности. Его центральные отделы выполнены фиброретикулярной тканью, в которой выявляются формирующиеся примитивные костные балки. В более глубоких отделах регенерата по направлению ко дну ложа дефекта наблюдаются многочисленные кровеносные сосуды, вокруг которых заметны признаки активного остеогенеза.
У крыс, дефект суставного хряща которых заполняли хитозановым гелем, на 60-е сутки отчетливо заметна область регенерата, который расположен в межмыщелковой ямке, имеет овальную форму, однородный, белого цвета. При гистологическом исследовании границы опила суставного хряща не имеют четких контуров. Величина диастаза между краями раны составляет 3,39±0,37 мм. Регенерат выполнен плотной неоформленной волокнистой тканью. На препаратах отчетливо заметно, как со стороны субхондральной костной пластинки по направлению к суставной поверхности происходит инвазия регенерата кровеносными сосудами и выселение малодифференцированных клеток из губчатой кости эпифиза.
У крыс, которым согласно протоколу эксперимента производили стандартный дефект, после чего вносили первичную культуру фетальных хондробластов с хитозановым гелем, на 60-е сутки наблюдения заметен регенерат, имеющий неоднородное строение и характеризующийся наличием темных и более светлых участков. При гистологическом исследовании видно, что сформировавшийся регенерат полностью заполняет дефект. Величина диастаза между краями раны составляет 2,61±0,23 мм и не имеет достоверных отличий от диаметра инструмента, которым наносился дефект. В области торцевых участков опила суставного хряща локализуются многочисленные группы из 4-8 клеток, основное вещество вокруг которых характеризуется интенсивной альцианпозитивной реакцией. Можно предполагать, что широкий слой матрикса гиалинового хряща, который определяется на границе регенерата и опила суставного хряща, формируется благодаря активному синтезу протеогликанов дифференцированными хондробластами донора, а также хондроцитами реципиента. Это позволяет заключить, что в основе регенерации лежит функциональная активность не только клеток донора, но и клеток реципиента.
Регенерат в полости дефекта образует конус роста, вершина которого граничит с субхондральной костной пластинкой, а основание обращено к суставной поверхности. Его центральная зона представлена низкодифференцированными пролиферирующими клетками; более дифференцированные клетки располагаются на периферии. В основании регенерата отмечаются признаки формирования типичных для нативного суставного хряща слоев. Со стороны суставной поверхности регенерат покрыт гомогенным интенсивно альцианпозитивным веществом. Клетки формирующегося тангенциального слоя овальной формы, их цитоплазма хорошо выражена, умеренно окрашивается гематоксилином. Плоскость расположения клеток параллельна суставной поверхности.
В более глубоких слоях регенерата хондробласты принимают овальную форму. Следует отметить, что изменяется плоскость расположения клеток - последние выстраиваются в колонки перпендикулярно суставной поверхности, как в препаратах нативного суставного хряща. Клетки регенерата, расположенные на границе с субхондральной костной пластинкой, не имеют признаков деструкции. В их цитоплазме, территориальном и межтерриториальном матриксе гистохимически определяется высокое содержание суммарных кислых ГАГ.
Таким образом, трансплантированные в дефект суставного хряща крысы фетальные хондробласты человека сохраняют функциональную активность в течение 60 суток, обеспечивая заполнение дефекта хрящевой тканью. Важной характеристикой трансплантата является отсутствие признаков воспалительной реакции в его толще и в окружающей ткани. Вероятно, это обусловлено снижением иммуногенности ксенотрансплантата за счет очищения культуры хондробластов в процессе культивирования от лейкоцитов-пассажиров (ко-стимуляторов иммунного ответа), а также низким уровнем экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости фетальными хондробластами. Очевидно, положительную роль играет также использование в качестве иммуномеханического барьера хитозанового геля, который отграничивает организм реципиента от трансплантата, обеспечивает сохранение жизнедеятельности инкапсулированных клеток и не препятствует диффузии образующихся в клетках биологических веществ. По данным Hsu S. (2004), Lee J.E. (2004), хитозановый гель выполняет и поддерживает объем дефекта, имеет хорошие показатели биосовместимости, блокирует синтез медиаторов воспаления, подавляет разрушительное действие свободнорадикальных соединений на межклеточный матрикс и снижает активность протеолитических ферментов. Следует отметить, что формированию органотипического регенерата способствовала и использованная при трансплантации малотравматичная техника оперативного вмешательства на коленном суставе. Сохранение подвижности сустава с первых часов послеоперационного периода может быть одним из существенных факторов, оказывающих положительное влияние на последовательную дифференцировку клеток суставного хряща.