Автореферат: Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе

В препаратах тел позвонков человека 12-летнего возраста и свиньи в возрасте 30-суток, в толще зоны пролиферации в плоскости, перпендикулярной продольной оси тела позвонка, отмечается активная инвазия межклеточного вещества хрящевой ткани кровеносными сосудами. В образцах ПР 30-суточных поросят в клетках эндотелия сосудов отмечается резко положительная реакция на NO-синтазу. В цитоплазме хондробластов, локализованных на периферии сосудистых каналов определяется повышение внутриклеточного содержания Са²⁺ и экспрессии белка р53. Данные клетки характеризуются отсутствием экспрессии белка Bcl-2, что возможно является особенностью хондробластов провизорного хряща, поскольку деление клеток в зоне пролиферации происходит достаточно быстро и обеспечение длительного «выживания» клеток в данном компартменте ПР не является обязательным. Индекс апоптоза в хондробластах зоны пролиферации ПР свиньи в её дорсальном отделе статистически достоверно превышает соответствующий показатель вентрального отдела на 8,73%. Дистрофия клеток и матрикса вокруг сосудистых каналов приводит к оссификации и остеогенезу.

Неравномерность развития заднего (дорсального) и переднего (вентрального) отделов ПР определяется более широким фронтом остеогенеза в зоне пролиферации ПР в её заднем отделе у человека, и дорсальном у свиньи.

В более поздний интервал постнатального периода онтогенеза (у человека старше 14-лет, а у свиньи старше 40-суток) неравномерность морфогенетических процессов в заднем (дорсальном) и переднем (вентральном) отделах ПР доступными методами не определяется.

Объяснение механизма структуризации ПР человека и свиньи может быть следующим. У человека в возрасте 11-12 лет, а у свиньи в период 7-30 суток ПР в зоне энхондрального остеогенеза плотно перекрыта костной тканью, и её рост осуществляется за счет увеличения зоны пролиферации. Расположенные в толще гиалинового хряща хондробласты пролиферирующей зоны оказываются удаленными от источников трофики - сосудов зоны энхондрального остеогенеза с одной стороны, а с другой - межпозвонкового диска. Вследствие этого клетки подвергаются дистрофии и гибнут. Именно в этой плоскости происходит инвазия хрящевого матрикса сосудами. Наличие крупных кровеносных сосудов в зоне пролиферации приводит к увеличению напряжения кислорода, повышенной генерации АКМ эндотелиальными клетками и хондробластами, свободнорадикальному повреждению компонентов хрящевого матрикса на периферии сосудистых каналов и апоптозу хондробластов.

Асимметричное расположение центра оссификации в теле позвонка человека и свиньи изначально является фактором, обусловливающим неравнозначность трофики и влияния регулирующих факторов (гормонов, факторов роста, цитокинов) на хондробласты переднего и заднего отделов ПР тела позвонка человека, а у свиньи - её дорсального и вентрального отделов, что предполагает существование морфофункциональных различий клеток в соответствующих отделах ПР и различной ответной реакции на регулирующие воздействия. В итоге это приводит к асимметрии роста ПР в переднем и заднем отделах тела позвонка человека, а у свиньи в дорсальном и вентральном отделах.

Анализ полученных результатов позволяет заключить: у человека, начиная с 12 недель (плодный период), а затем в первую (от рождения и до 6-7 лет), а также вторую фазы развития позвоночника (от 7 до 12 лет) морфогенетические процессы, обеспечивающие увеличение массы тел позвонков и структуризацию их элементов, происходят неравномерно. Эта закономерность характерна и для свиньи, с той лишь разницей, что соответствующие фазы развития тел позвонков реализуются с 6 недель пренатального периода онтогенеза до 30 суток постнатального периода онтогенеза. Неравномерность развития структурных элементов тела позвонка в более поздние периоды онтогенеза доступными методами не определяется. Полученные данные об особенностях структурно-функциональной организации ПР тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе позволили провести параллели и выделить общие закономерности её гистогенеза (табл. 7).

Таблица. 7. Структурно-временные параллели формирования пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе

Неравномерность роста и развития заднего (дорсального) и переднего (вентрального) отделов ПР тела позвонка в период её формирования и структуризации, является морфологической основой развития возможных деформаций тел позвонков как у человека, так и свиньи. Очевидно, что при одинаковых воздействиях гормонов, цитокинов, факторов роста на клетки ПР, например, во время гормонального пика в период интенсивного роста и полового созревания, реакция клеток разной степени дифференцировки неодинакова. С этой точки зрения, возрастные особенности формирования ПР могут рассматриваться как морфологическая основа такой классической ортопедической патологии позвоночного столба человека, как идиопатический сколиоз. Наши данные согласуются с предложенной М.Г. Дудиным (2003) концепцией этиопатогенеза идиопатического сколиоза, которая постулирует, что при нарушении гормонального фона, например, при высоком содержании кальцитонина и соматотропина, передние отделы тела позвонка опережают в развитии задние на уровне суставных отростков. Компенсация этого состояния происходит за счёт торсии удлиненных передних отделов вокруг относительно укороченных задних.

Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать параметры отбора и оценки клеточного материала для использования в клеточных технологиях. Так, оптимальным периодом отбора хрящевой ткани в качестве источника клеточного материала для создания тканеинженерных конструкций является у человека срок 12 недель, а у свиньи - 6 недель гестации, поскольку содержание низкодифференцированных клеток в гиалиновом хряще зоны роста составляет более 70%. Для оценки степени дифференцировки клеток целесообразно использовать совокупность параметров: коэффициент формы ядра, площадь клетки, ядерно-цитоплазматическое отношение. Вместе с тем, широкому внедрению ксенотрансплантации в практику должны предшествовать комплексные исследования по изучению закономерностей пролиферации и дифференцировки клеток в динамике их развития in vitro.

2. Структурно-функциональная характеристика первичной культуры клеток, выделенных из зоны роста тела позвонка плода человека на 12 неделе гестации

Первичная культура клеток, выделенная из хрящевой зоны роста тела позвонка плода человека, на первом пассаже выглядит разреженной и представлена тремя типами клеток. Клетки всех типов имеют округлую или овальную форму и статистически достоверные различия площади клетки, коэффициента формы ядра и ядерно-цитоплазматического отношения (рис. 2). Мелкие клетки обозначены как клетки 1-го типа, среднего размера - как клетки 2-го типа и самые крупные - клетки 3-го типа.

Округлые клетки 1-го типа площадью 60,90±3,72 мкм², являются преобладающими на первом пассаже, их содержание достигает 78,93%. Округлое ядро содержит преимущественно гетерохроматин и занимает значительный объем клетки. Цитоплазма слабо выражена, умеренно базофильная.

Клетки 2-го типа преимущественно овальные, площадью 98,5 ± 2,31 мкм², составляют 18,03 % клеточной популяции. Ядро лежит эксцентрично и, в зависимости от плоскости расположения в клетке, имеет бобовидную, овальную или форму уплощенного диска. Цитоплазма обильная, умеренно оксифильная.

Клетки 3-го типа содержат крупное овальное ядро с небольшим количеством эухроматина. В цитоплазме выявляются мелкие оксифильные гранулы. Это самая малочисленная группа клеток на данном пассаже, составляющая 3,05%.

При постановке ШИК-реакции в цитоплазме клеток 1-го типа выявляется пылевидный интенсивно окрашенный материал. Предварительная инкубация клеток в растворе амилазы полностью подавляет реакцию. Клетки 2-го и 3-го типов содержат гранулярное, интенсивно окрашенное реактивом Шиффа вещество, заполняющее весь объем цитоплазмы. Гранулы в цитоплазме клеток 3-го типа крупнее, чем в клетках 2-го типа и локализованы преимущественно на периферии. Обработка срезов амилазой значительно понижает интенсивность ШИК-реакции.

Клетки всех типов различаются как по интенсивности окрашивания альциановым синим на кислые ГАГ, так и по морфологии альцианпозитивных гранул. В клетках 1-го типа мелкодисперсное вещество заполняет весь объем цитоплазмы. Клетки 2-го и 3-го типов, напротив, содержат крупные гранулы альцианпозитивного вещества, расположенные диффузно. В реакции с толуидиновым синим на КС в цитоплазме клеток 1-го типа отмечается незначительное количество пылевидного бледно окрашенного вещества. Клетки 2-го и 3-го типов характеризуются накоплением мелких, умеренно окрашенных в лиловый цвет гранул, диффузно расположенных в цитоплазме. При постановке реакции на ХС в клетках 1-го типа интенсивность окрашивания и распределение толуидинпозитивного материала аналогичны таковым при выявлении КС. В клетках 2-го и 3-го типов содержатся многочисленные крупные гранулы, воспринимающие толуидиновый синий при значении рН 2,5 раствора красителя, которые сливаются и заполняют всю цитоплазму.

Рис. 2. Морфометрические показатели клеток 1, 2 и 3-го типов первичной культуры. А - площадь клетки; В - ядерно-цитоплазматическое отношение; С - коэффициент формы ядра.

Примечание: различия между клетками 1, 2 и 3 типов достоверны (* р ? 0,05; ** р ?0,01; *** р ? 0,001).

Анализ величины ядерно-цитоплазматического отношения всех типов клеток свидетельствует о статистически достоверном снижении этого показателя от клеток 1-го типа к клеткам 3-го типа, что говорит об увеличении степени дифференцировки клеток, равно как и изменения коэффициента формы ядра (рис. 2 В, С). Наименее дифференцированными являются клетки 1-го типа, а наиболее - клетки 3-го типа, что подтверждается усложнением ультраструктурной организации клеток по направлению от клеток 1-го типа к клеткам 3-го типа. В цитоплазме более дифференцированных клеток 2-го и 3-го типов отмечаются морфологические признаки повышения синтетической активности: увеличивается протяженность цистерн шероховатого ЭПР, в их полости накапливается тонкогранулярный материал, электронная плотность которого несколько выше, чем плотность цитоплазмы. По мере дифференцировки клеток нарастает количество элементов аппарата Гольджи, усложняется его организация. На срезах наблюдается формирование пузырьков с гомогенным (в отличие от зернистого содержимого цистерн ЭПР) содержимым низкой электронной плотности. Многочисленные гладкомембранные и «опушенные» везикулы в зоне аппарата Гольджи свидетельствуют об интенсивном внутриклеточном транспорте компонентов, синтезируемых в этом органоиде, а также об активных процессах гликозилирования, которые свойственны хондробластам. Лизосомальные структуры в хондробластах первого пассажа немногочисленны.

Таким образом, клетки первичной культуры фетальных хондробластов человека на 1-ом пассаже представляют собой популяцию активно дифференцирующихся клеток с признаками нарастающей синтетической активности. Клетки всех типов синтезируют специфические биополимеры хрящевой ткани - сульфатированные и несульфатированные ГАГ, а также коллаген II типа, выявляющийся при постановке иммунохимической реакции с вторичными антителами. Цитохимические свойства позволяют определить три типа клеток как низкодифференцированные, среднедифференцированные и высокодифференцированные хондробласты.

Первичная культура клеток на 2-ом пассаже образует равномерный плотный монослой, сформированный тремя типами клеток. Морфометрический анализ выявил изменение соотношения между клетками трех типов: содержание 1-го типа снизилось до 59,21%, а содержание клеток 2-го и 3-го типов возросло до 34,06% и 6,73%, соответственно. Морфология клеток 1-го и 3-го третьего типов не отличалась от таковой на 1-ом пассаже.

Клетки 2-го типа на светооптическом уровне имеют овальную форму и ядро, в большинстве случаев бобовидной формы, как правило, смещенное к одному из полюсов клетки. Ядро неравномерно окрашивается гематоксилином, что особенно заметно в суспензии снятых со стекла клеток. Цитоплазма содержит гранулярные структуры, которые также неравномерно окрашиваются гематоксилином. Характерным признаком является присутствие клеток 2-го типа, как с фигурами митоза, так и с фрагментированным ядром, сморщенной и неравномерно окрашенной цитоплазмой.