Автореферат: Морфофункциональные характеристики синусно-предсердного узла сердца крысы

6. Распределение плотностей М-холинорецепторов, в-адренорецепторов, дофаминовых и опиоидных рецепторов в латеральной зоне центральной части синусно-предсердного узла носит общий характер. Указанный характер распределения плотностей рецепторов определяет направление и степень передвижения доминантного пейсмекерного региона.

7. Процессы старения в организме крыс приводят к увеличению линейных размеров синусно-предсердного узла, миграции доминантного пейсмекерного региона вниз по артерии синусно-предсердного узла, увеличению диаметров, как клеток-водителей ритма, так и окружающих рабочих атриальных кардиомиоцитов, урежению собственной частоты генерации потенциалов действия истинными клетками-водителями ритма и увеличению ширины пика потенциалов действия истинных и латентных клеток-водителей ритма.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на: Юбилейной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной морфологии» (Санкт-Петербург, 1997); Всероссийской научной конференции по патологической анатомии памяти И.К. Есиповой и В.Н. Галанкина (Москва, 2001); Научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2003); IV конгрессе Международной ассоциации морфологов (Уфа, 2002); Научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2003); . III российской научной конференции « Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения» (Уфа, 2005); VI Общероссийской научной конференции с международным участием «Успехи современного естествознания» (Сочи, 2005); IV научной конференции «Проблемы морфологии. Теоретические и клинические аспекты» (Астрахань, 2005); Международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека» (Астрахань, 2007); Научно-практической конференции с международным участием, посвященная 85-летию со дня рождения доктора медицинских наук, профессора Степанова Петра Федоровича (Смоленск, 2009); совместная научно-практической конференции коллективов кафедр морфологии МБФ, фундаментальной и прикладной физиологии МБФ, гистологии и эмбриологии лечебного факультета РГМУ и кафедры гистологии ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 14 апреля 2010).

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедрах: физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, фундаментальной и прикладной физиологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет» и морфологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

По теме диссертации получено авторское свидетельство: «Устройство для исследования образца переживаемой ткани. (Патент RU 2063704, выдан 20. 07. 1996, Бюл. № 20). Автор участвовал с указанным устройством в выставке «Научные разработки и медицинская техника вчера и сегодня» и удостоен нагрудного знака «УЧАСТНИК ВВЦ» (Свидетельство № 18, постановление от 7.04.2000 № 24). Камера использовалась в 2007 году в совместных исследованиях с сотрудниками “Division of Cardiovascular and Endocrine Sciences. University of Manchester” (руководитель - prof. M.R. Boyett).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из одного тома и содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации» и «Список литературы». Работа изложена на 362 страницах и включает в себя 4 таблицы и 91 иллюстрацию. Список литературы состоит из 607 источников, из которых 43 - отечественных и 564 - иностранных.

2. Материалы и методы исследований

Объект исследования. В экспериментах использовали самцов крыс линии «Вистар». Все исследованные животные были получены из вивариев, где содержались в пластиковых клетках с металлическими решетками, получали стандартное питание и квалифицированный ветеринарный уход - протокол Этического Комитета РГМУ № 50 от 20 июня 2005 года. Весь экспериментальный материал в диссертации получен на 204 животных.

Условно экспериментальные крысы были подразделены на три группы:

1. Молодые, возрастом около 1.5-2 месяцев, массой тела 119±14 граммов (P < 0.05), в количестве 141 особь.

2. Взрослые, возрастом 3 месяца, массой тела 328±9 граммов (P < 0.05), в количестве 32 особь.

3. Старые, возрастом 24 месяца, массой тела 653±30 граммов (P < 0.05), в количестве 31 особь.

Исследование сердечной функции с использованием внеклеточных отведений. У крыс, анестезированных кетамином (100 мг/кг массы тела) и ксилазином (5 мг/кг массы тела) записывали поверхностную электрокардиограмму. После этого животных анестезировали фенобарбиталом (50 мг/кг массы тела) и изготавливали препарат изолированного сердца по Лангендорфу, перфузируемый раствором Кребса-Рингера, уравновешенным смесью 95% О₂ и 5% СО₂ до рН = 7.4. Регистрирующие крючкообразные хлорсеребряные электроды прикрепляли к левому желудочку и правому ушку. Сигнал от них поступал на входы электрокардиографа. К правому ушку также прикрепляли стимулирующие биполярные электроды. Собственный сердечный ритм in vitro определяли после записи, по меньшей мере, 60 последовательных сердечных циклов. Время восстановления синусно-предсердного узла (ВВСПУ) определялось в условиях электрической стимуляции предсердий в течение 10 секунд с частотой стимулирующих импульсов, превышающей на 2 Hz собственный сердечный ритм. ВВСПУ измерялся как интервал времени между окончанием последнего стимулирующего стимула и началом первой спонтанной Р-волны. С целью учета индивидуальных различий между животными в собственных сердечных ритмах ВВСПУ нормализовали вычитанием из него периода следования сердечных сокращений Т_сл. Нормализованное ВВСПУ называется корректированным ВВСПУ (ВВСПУ_К). Итак, ВВСПУ_К = ВВСПУ - Т_сл.

Метод регистрации электрической активности клеток синусно-предсердного узла сердца крысы. Под нембуталовым наркозом (40 мг/кг массы тела) у крыс выделяли участок правого предсердия, содержащий переднюю стенку, верхнюю и нижнюю полые вены и правое ушко. Маркером синусно-предсердного узла служила его артерия, стенки которой окрашивали 0.01% раствором трипанового синего на растворе Хенкса. Затем препарат закрепляли и помещали в проточную термостатируемую кювету оригинальной конструкции объемом 10 мл, заполненную раствором Кребса-Рингера, уравновешенного смесью 5% СО₂ и 95% О₂ до рН = 7.4. Регистрация электрической активности кардиомиоцитов синусно-предсердного узла проводилась с помощью общепринятых стеклянных микроэлектродов, заполненных 3М KCl с диаметром кончика не более 0.5 мкм и сопротивлением до 60 мОм. Введение микроэлектродов ткань синусно-предсердного узла осуществлялось при помощи микроманипулятора КМ-1 под контролем микроскопа. В части экспериментов регистрирующая система состояла из усилителя постоянного тока УПТ-2 и двухлучевого запоминающего осциллографа С8-14. Кривые потенциалов действия кардиомиоцитов синусно-предсердного узла на экране осциллографа снимались на фотопленку с помощью фотоаппарата. В других (более поздних) экспериментах электрические сигналы c усилителя постоянного тока оцифровывались на 5 кГц с использованием Digidata 1322A A/D converter (Axon Instruments Inc., Union city, USA) и обрабатывались с использованием программы Axoscope (ver. 10).

Обработка данных электрофизиологических исследований. На зарегистрированных кривых потенциалов действия измерялись общепринятые в электрофизиологии кардиомиоцитов параметры: максимальный диастолический потенциал (МДП); реверсия потенциала выше нулевой линии - овершут (ОШ); амплитуда потенциала действия (АПД = МДП + ОШ); относительный порог самовозбуждения мембраны (ОПСМ) -потенциал, при котором фаза медленной диастолической деполяризации (фаза 4) переходит в фазу начального быстрого подъема потенциала (фазу 0); период следования (Т_сл) - временной интервал между двумя последовательными потенциалами действия. Кроме указанных параметров регистрировались также ШП₂₅ - ширина пика на уровне 25% АПД, ШП₈₅ - ширина пика на уровне 85% АПД, крутизна нарастания потенциала в фазе 4 (КНПф4) и крутизна нарастания потенциала в фазе 0 (КНПф0), которая рассчитывалась как dV/dT_max в фазах 4 и 0, соответственно. Частота следования потенциалов действия (ЧСПД) рассчитывалась по следующей формуле:

ЧСПД = 1/Т_сл.

Окрашивание гистологических срезов. Для гистологического исследования использовали как замороженные, так и заключенные в парафин препараты правых предсердий, с которых изготавливались срезы толщиной ?10 µm (плоскость среза ориентировалась параллельно или перпендикулярно crista terminalis). Оба типа срезов затем окрашивались трехцветной окраской по Массону.

Метод электронной микроскопии. Морфология клеток-водителей ритма изучалась на молодых животных. Обработка материала проводилась традиционным способом, после чего образцы заливали в Эпон-812 или Аралдит. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронных микроскопах Hitachi HU-11E-2, Hitachi HU-12 и BS 500 при увеличениях от 3.2 до 31 тысяч.

Метод изучения передвижения доминантного пейсмекерного региона в ответ на введение в культуральную среду норадреналина и ацетилхолина. Местоположение доминантного пейсмекерного региона (места локализации группы истинных клеток-водителей ритма) определяли с помощью стеклянных микроэлектродов и фиксировали по шкале линейки, вставленной в объектив микроскопа. После обнаружения доминантного пейсмекерного региона в кювету последовательно (через 15-минутные отмывки) вводили растворы норадреналина битартрата (“Serva”) в возрастающих концентрациях (мг/мл): 0.6х10^-4, 1.2х10^-4 и 1.8х10^-4 (1-ая серия экспериментов). Во время каждого введения определяли местоположение доминантного пейсмекерного региона. В ходе эксперимента также регистрировали базальный уровень частоты следования потенциалов действия и его изменения при введении норадреналина в разных концентрациях. Чтобы исключить возможные артефакты, связанные с многократным введением норадреналина в кювету, была предпринята 2-ая серия экспериментов, в которой норадреналин вводили однократно в концентрациях (мг/мл): 1.2х10^-4, 1.8х10^-4 и 3.6х10^-4. Ход экспериментов с использованием ацетилхолина в 1-ой серии полостью повторял таковой для норадреналина. Выбранные концентрации для ацетилхолина составляли 25х10^-4, 50х10^-4 и 75х10^-4 мг/мл. 2-ая серия экспериментов с ацетилхолином проводилась с этими ж концентрациями, но между последующими введениями ацетилхолина использовались промежуточные 15-минутные отмывки.

Авторадиографическое исследование относительных плотностей связывания ³H-DHA, ³H-QNB, ³H-дофамина и ³H-DAGO в центральной части синусно-предсердного узла сердца крыс. В ходе электрофизиологического эксперимента после обнаружения доминантного пейсмекерного региона стеклянный микроэлектрод оставляли в ткани, а культивационную среду в кювете меняли на промывочную. Состав сред и техника проведения реакций связывания лигандов использовались в соответствии с методиками, успешно примененными В.В. Глинкиной [Глинкина В.В., 1990; Ярыгин В.Н., и др., 1990] для исследования вегетативных ганглиев. По окончании процесса связывания в кювету вводили 4% раствор глютарового альдегида на буфере Миллонига и фиксировали препарат в течение 2 часов. Участок правого предсердия, содержащий область синусно-предсердного узла постфиксировали в 1% OsO₄ на буфере Миллонига, дегидратировали и заливали в Эпон-812. Авторадиографическое исследование плотности распределения тритиевой метки проводили на последовательных срезах толщиной 3 мкм, окрашенных 1% метиленовым синим, в темноте покрытых фотографической эмульсией Amersham LM-1. Высушенные срезы выдерживались при 4 ⁰С. По истечении года проводили стандартный процесс проявления в проявителе D-19 (Kodak). Анализ изображения проводился на измерительном микроскопе Люмам-И-3 с увеличением объектива 40. Изображение с объектива проецировалось на видеокамеру, размеры поля зрения в которой составляли 26.5 х 32.5 мкм². Денситометрические измерения проводились в непосредственной близости от стенки артерии синусно-предсердного узла, а для ³H-дофамина - также и непосредственно в стенке сосуда, с шагом 0.05 мм вверх и вниз вдоль артерии от местоположения доминантного пейсмекерного региона. Для сравнения измеряли плотность авторадиографической метки в ткани рядом расположенного перинодального атриального рабочего миокарда. Захваченные видеокамерой изображения с использованием устройства “AverMedia EZCapture 2.5” подвергались компьютерному анализу с использованием программы “Adobe Photoshop 5.0”. Результатом служило процентное содержание площади поля зрения, занятое зернами авторадиографической метки. Относительная плотность указанной метки рассчитывалась как отношение процентного содержания площади, занятой меткой в текущем поле зрения, к таковой, максимальной для данного среза. Далее для каждого среза строили графики распределения относительной плотности авторадиографической метки вдоль артерии синусно-предсердного узла.

Статистическая обработка данных. Все результаты оценивались по t-критерию Стьюдента с использованием программы SigmaStat. Различия считались значимыми на уровне P<0.05. Подробный отчет по количеству крыс разных возрастов, использованных в сериях экспериментов, приведен в Таблице 1.

Таблица 1. Таблица учета экспериментальных животных

Результаты исследования и их обсуждение

Электрофизиологические характеристики клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс. Синусно-предсердный узел сердца крыс построен истинными и латентными клетками-водителями ритма.

Рис. 1. Форма кривой потенциала действия истинной клетки-водителя ритма (а) и один из вариантов (б) распределения электрофизиологических типов клеток вдоль артерии синусно-предсердного узла.