Статья: Оценка динамики количества генов, ответственных за деградацию нефтепродуктов в загрязненной почве

Оценка динамики количества генов, ответственных за деградацию нефтепродуктов в загрязненной почве

Л.Р. Бикташева, А.А. Савельев, П.А. Курынцева, С.Ю. Селивановская, П.Ю. Галицкая, Казанский (Приволжский) федеральный университет

Аннотация

Проведено лабораторное моделирование нефтяного загрязнения трех уровней (60, 120 и 250 г/кг) трех типов почв - дерново-подзолистые, серые лесные и чернозем типичный. Установлено, что в течение 120 сут содержание масляных фракций (смеси алифатических и ароматических углеводородов) снижалось в образцах с низким и средним уровнями загрязнения на 10-27% и 2-24% соответственно. Выявлено, что нефтяное загрязнение во всех концентрациях привело к снижению общей численности бактерий по сравнению с незагрязненной почвой в 1.2-5.5 раз.

Показано, что количество генов, кодирующих алкан-монооксигеназу (alkl), и генов грамположительных бактерий, кодирующих ферменты деградации ПАУ (GP-PAH), коррелировало с общей численностью бактерий и уменьшалось в случае загрязнения нефтью всех типов почв. Напротив, количество генов, кодирующих алкан-монооксигеназы (alkII и alkIII), а также генов грамотрицательных бактерий, кодирующих ферменты деградации ПАУ (GN-PAH), было выше во всех почвах, загрязненных нефтью, по сравнению с незагрязненными. Статистическая обработка полученных результатов позволила установить, что уровень загрязнения почвы нефтепродуктами является значимым фактором для динамики количества генов групп alkl, alkII, GN-PAH, GP-PAH, а длительность эксперимента - для генов групп alkl, alkIII, GN-PAH, GP-PAH. Тип почв является значимым фактором для динамики числа бактерий и генов групп alkIII и GP-PAH, для остальных групп генов тип почвы не оказывает влияния.

Ключевые слова: нефтезагрязненные почвы, биодеградация, алкан-монооксигеназы, диоксигеназы

Abstract

Assessment of the number of catabolic genes of oil-contaminated soils

L.R. Biktasheva, A.A. Saveliev, P.A. Kuryntseva, I.Y. Selivanovskaya, P.Y. Galitskaya Kazan Federal University

In this work, laboratory modeling of three levels of oil contamination (60, 120 and 250 g kg^-1) was carried out for three types of soil: eutric podzoluvisols, haplic greyzem, and haplic chernozems. It was found that the content of fraction of aliphatic and aromatic hydrocarbons decreased in the samples with

low and medium levels of contamination within 120 days. Oil contamination of soil in all concentrations led to a decrease in the total number of bacteria in comparison with uncontaminated soil by 1.2-5.5 times. It was shown that the number of genes belonging to the alkI and GP-PAH groups was in line with the total number of bacteria and decreased after oil contamination. At the same time, the number of alkanemonooxygenase genes belonging to the alkII and alkIII groups, as well as the genes of the GN-PAH group, was higher in the oil-contaminated soils as compared to the uncontaminated ones. Statistical analysis of the results showed that the level of soil contamination is a significant factor for the dynamics of the number of genes belonging to the alkI, alkII, GN-PAH, GP-PAH groups, as well as the duration of the experiment for alkI, alkIII, GN-PAH, GP-PAH groups. Soil type is a significant factor for the dynamics of the number of bacteria and number of genes belonging to the alkIII and GP-PAH groups. For other groups of genes, the type of soil is not a significant factor.

Keywords: oil-contaminated soils, biodegradation, alkane monooxygenase, dioxygenase

Введение

Загрязнение почв является серьезной проблемой для естественных экосистем. Нефтяное загрязнение несет за собой множество негативных эффектов, таких как ухудшение агрохимических характеристик почв, токсическое действие компонентов нефти на организмы и прочие [1, 2].

В естественных условиях за деградацию нефтепродуктов отвечают микроорганизмы, в первую очередь бактерии [3]. Бактериальные организмы имеют множество механизмов, позволяющих им трансформировать углеводороды с помощью внутриклеточных ферментов, образование которых контролируется специфическими генами [4]. Многие исследователи отмечают, что оценка количества генов, кодирующих катаболические ферменты, ответственные за трансформацию углеводородов, позволяет анализировать разнообразие популяций, имеющих потенциал к биодеградации [1, 5-10].

Нефтяные отходы или сырая нефть, загрязняющие почву, как правило, представляют собой сложную смесь из углеводородов различного строения. Наиболее полно утилизировать компоненты нефти может микробный консорциум, разные представители которого способны трансформировать различные группы углеводородов [11]. Например, представители рода Alcanivorax способны деградировать короткоцепочечные и среднецепочечные н-алканы, представители рода Rhodococcus - трансформировать н-алканы, а также бензол, толуол, ксилол и бифенил, представители рода Pseudomonas известны способностью деградировать нафталин, фенантрен, пирен и другие полиароматические углеводороды (ПАУ), а представители рода Alcaligenes отличаются способностью разлагать антрацен и фенол [12-19].

За деградацию углеводородов отвечают целые группы ферментных комплексов. Одним из ключевых ферментов, участвующих в деградации алканов и играющих важную роль в биоремедиации сырой нефти, является алкан-гидроксилаза [20]. Гены, отвечающие за синтез алкан-гидроксилазы, принято классификационно разделять на три группы на основании способности к трансформации алканов определенной длины (с короткой, средней и длинной цепью) [21].

Разложение ароматических соединений (бензола, толуола, этилбензола, ксилола) начинается с прямого окисления ароматического кольца с помощью монооксигеназ или диоксигеназ либо с окисления боковой алкильной цепи, которое катализируется монооксигеназой [22-25]. Расщепление самого кольца происходит при участии катехол 2,3-диоксигеназы [26]. Первый этап деградации нафталина и других низкомолекулярных ПАУ (с двумя-тремя кольцами) осуществляется нафталиндиоксигеназой [27, 28]. К генам, кодирующим способность разлагать ПАУ, относятся cat-2,3, narAa, phdA/pdoA2, nidA/pdoA1, nidA3/fadA1, nah, nahAc, nahA3, nagAc, ndoB, ndoC2, pahAc, pahA3, phnAc, phnA1, bphAc, bphA1, dntAc и arhA1.

Активность микроорганизмов при биодеградации нефти во многом определяется составом сообщества и физико-химическими характеристиками почвы и уровнем ее загрязнения [29]. В первую очередь на способность микробного сообщества потреблять углеводороды влияет уровень загрязнения почв. Известно, что их низкая концентрация может стимулировать сообщество, а высокая - ингибировать его. С точки зрения степени воздействия нефти на микробное сообщество, к низкому уровню загрязнения относятся концентрации ниже 10%. Считается, что при таком загрязнении численность и активность микробного сообщества возрастают, тогда как средние и высокие концентрации (более 10%) влияют на сообщество негативно [30, 31]. Согласно известным данным [32, 33], на микробное сообщество, а значит, и на деградацию нефтепродуктов влияют и свойства самой почвы, такие как гранулометрический состав, содержание органических веществ, кислотность и другие характеристики. Эффективность биодеградации нефтепродуктов зависит и от того, насколько изменяется биодоступность углеводородов в зависимости от свойств почв [34, 35]. Однако взаимосвязь между факторами окружающей среды и распределением катаболических генов в почвах до сих пор остается неясной.

Цель настоящей работы - оценить взаимосвязи между количеством генов, отвечающих за деструкцию углеводородов, и уровнем нефтяного загрязнения, а также длительностью процесса воздействия и типом почв.

Материалы и методы

Лабораторный эксперимент проводили, используя три типа почв: дерново-подзолистые (Д11) и серые лесные (СЛ) почвы, а также чернозем типичный (ЧТ). Пробы искусственно загрязнялись нефтью до концентрации 60, 120 и 250 г/кг (образцы с низкой концентрацией нефти - НК, средней - СК и высокой - ВК). Образцы нефти были отобраны на Марийском нефтеперерабатывающем заводе (Республика Марий Эл, Россия). В качестве контрольных образцов использовали незагрязненные почвы всех типов. Эксперимент проходил при комнатной температуре и ежедневном перемешивании в течение 120 сут.

Оценка содержания нефтепродуктов и их фракционного состава. Общее содержание нефтепродуктов было оценено в начале и конце эксперимента. Экстракция нефтепродуктов из почв проводилась методом избирательной экстракции хлороформного битумоида типа А (ХБА) в два этапа (первый - холодная экстракция в аппарате Сокслета, второй - горячая экстракция в аппарате Сокслета) [36]. Дальнейшая количественная оценка была проведена гравиметрическим методом. Групповой анализ экстрактов, включающий выделение и определение количественного содержания фракций масел, смол и асфальтенов, проводили с помощью адсорбционно-хроматографического метода Маркуссона - Саханова [37]. В масляных фракциях методом ГЖХ (Кристалл 5000, Хроматэк, г. Йошкар-Ола, Россия) определялся индивидуальный состав алкановых углеводородов нормального и изопреноидного строения.

Анализ количества генов методом qPCR. Общая геномная ДНК была экстрагирована с помощью коммерческого набора FastDNA®SPIN Kit for Soil (Bio101, Qbiogene, Heidelberg, Германия). Образцы ДНК хранились при -20 °C. Количество специфических генов было проанализировано с помощью количественной ПЦР (qPCR). qPCR-анализ проводили с использованием общебактериальных праймеров 341F/534R [38] и специфических праймеров, представленных в табл. 1. Реакционная смесь включала в себя 0.1 U/мкл полимеразы SynTaq, 1-кратный буфер с красителем SYBR Green, 2.5 мМ MgCl2, по 200 мкМ каждого dNTP, 0.2 мкМ каждого праймера и 1 мкл ДНК.

Амплификация осуществлялась на приборе CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Германия) при следующем режиме: 15 мин при 95 °С и 39 циклов, включающих 30 с при 95 °C, 30 с при T_m и 30 с при 72 °C. Стандартная кривая для оценки общего числа бактерий была построена с использованием серийного разведения ДНК Pseudomonas fluorescence. Стандартная кривая для катаболических генов была построена на основе данных амплификации серии разведений ДНК позитивного клона, несущего искомый ген. Концентрация плазмидной ДНК была измерена с помощью Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, США). Все анализы были выполнены в трех повторностях при эффективности 94% и значениях R2 больше 0.99.

Табл. 1. Праймеры, использованные в работе

Статистическая обработка результатов. Все исследования проводили не менее чем в трех повторностях. Полученные данные были обработаны с использованием программы Origin 8.5 (OriginLab, США). Дополнительная обработка данных и моделирование проводились в статистической системе R [40].

Был проведен корреляционный анализ взаимосвязей между основными результирующими характеристиками (конечным содержанием алканов, динамикой количества бактерий и катаболических генов) и исходными параметрами образцов (начальными концентрациями нефти, типом почв и днем эксперимента). Для этого была построена модель, оценивающая влияние начальной концентрации нефти, типа почв и длительности эксперимента:

^ln(^Yjk) = «о + Р,- + Мг + «i * effect, + г_1]к^,

где Y_jk - значение характеристики для -го дня наблюдения, ]-й концентрации нефти, и к-го типа почвы; а₀ - значение логарифма Y_i]k для нулевого дня, нулевой концентрации и почвы ДП, которые являются базой сравнения; Р - изменение логарифма Y_i]k для -го дня наблюдения по сравнению с базой сравнения; oil.fact- - значение -й фактической начальной доли нефти, «- коэффициент для вычисления изменения логарифма ^УФ за счет доли нефти по сравнению с базой; - изменение логарифма У_к для к-го типа почвы по сравнению с базой сравнения; &у_к - случайная ошибка (на логарифмической шкале).

Для оценки корреляции содержания алканов на 120 -й день от исходных параметров (начальные концентрации нефти и тип почв) была построена модель, аналогичная описанным, однако вместо значения У было использовано значение его логарифма.

Результаты и их обсуждения

Оценка общего содержания нефтепродуктов и их фракционного состава. На первом этапе работ была оценена эффективность утилизации нефтяного загрязнения микробными сообществами трех типов почв (дерново - подзолистая, серая лесная и чернозем типичный) в течение 120 сут. Начальное содержание нефтепродуктов в образцах НК составило 49-53 г/кг, в образцах СК - 85-118 г/кг и в образцах ВК - 182-203 г/кг (табл. 2). При оценке количественного содержания масел (смеси алифатических и ароматических углеводородов), смол и асфальтенов установлено, что сразу после загрязнения в почве преобладали смолы - 35-50%, содержание масел составило 35-49%, наименьшая доля приходилась на асфальтены - 12-17%. Различия в составе фракций нефти для разных типов почв не обнаружены.

Табл. 2 Содержание нефтепродуктов и их фракций в почвах различных типов при их искусственном загрязнении