Статья: Оценка динамики количества генов, ответственных за деградацию нефтепродуктов в загрязненной почве

В течение 120 сут эксперимента суммарное содержание углеводородов в почве изменилось незначительно - для образцов НК и СК оно снизилось на 4-10% относительно исходного, а для образцов ВК было сопоставимым с исходным содержанием. При этом содержание ароматических и алифатических углеводородов снизилось, а смол и асфальтенов, соответственно, увеличилось. Так, для образцов НК наблюдалось снижение содержания фракции масел на 10-27% с максимальным снижением в образце СЛ. Образцы СК характеризовались снижением масел на 2-24%, с максимальным снижением для образца ДП.

Для подтверждения деградации короткоцепочечных углеводородов нами был проведен анализ содержания насыщенных алканов непосредственно после загрязнения, а также через 120 сут эксперимента. Анализ проведен на примере образца СЛ с начальной концентрацией нефти 120 г/кг (рис. 1).

Видно, что сразу после загрязнения масляная фракция образца СЛ12 была представлена н-алканами с гомологами от С₁₄ до С₄₀ с максимумом распределения в среднемолекулярной области С₁₇-С₂₁. Однако к концу эксперимента максимум в распределении н-алканов сдвинулся в высокомолекулярную область. Это может говорить о том, что низкомолекулярные углеводороды линейного строения с С₁₄ до С₃₀ подверглись биодеградации. Другие авторы также отмечают, что микробной биодеградации в первую очередь подвергаются обычно нормальные алканы С₁₀-С₂₀ [41-43].

Рис. 1. Хроматограммы масляной фракции образца СЛ с концентрацией нефти 120 г/кг на 0-е (а) и на 120-е (б) сутки после загрязнения

Следует отметить, что снижения содержания алифатических и ароматических соединений для образцов ВК не наблюдалось, в отличие от образцов с меньшим уровнем загрязнения. Это можно объяснить тем, что низкие концентрации нефтепродуктов в почве стимулировали активность углеводородокисляющей группы микроорганизмов почвы, тогда как высокие ингибировали ее [44, 45].

Оценка общей численности бактерий и количества генов, кодирующих ферменты деградации углеводородов. Загрязнение нефтью может как снижать, так и увеличивать численность бактерий в почве, а также изменять активность микробных сообществ [46-49]. Для этого была проведена оценка общей численности бактерий (на основании числа копий генов 16S рРНК) и числа катаболических генов методом qPCR. Результаты оценки численности бактерий представлены на рис. 2.

а) б) в)

Рис. 2 Численность бактерий в почвах различных типов (а) с разными уровнями загрязнения (б) на 0-е, 30-е, 60-е и 120-е сутки эксперимента (в). На вертикальной оси представлены значения количества копий генов, середина прямоугольника представляет собой среднее значение, прямоугольник - крайнее стандартное отклонение

Начальная численность бактерий в незагрязненных почвенных образцах находилась в пределах 1.3 * 10⁷ (образец ЧТ) - 1.4* 10⁷ (образец ДП) копий генов/г. С повышением степени загрязнения почв численность бактерий снижалась в среднем в 1.2-5.5 раз, а разброс значений увеличивался. Согласно результатам оценки численности для разных типов почв можно отметить некоторое снижение численности бактерий в образцах чернозема типичного. Оценка численности бактерий в зависимости от времени эксперимента показывает некоторое увеличение численности на 30-60-е сутки, и дальнейшее снижение к 120-м суткам.

На следующем этапе была проведена оценка числа генов, кодирующих синтез алкан-монооксигеназ. Содержание катаболических генов было рассчитано в процентах по отношению к количеству копий генов 168 рРНК. Относительное количество генов группы а1к1 в незагрязненных почвах находилось на уровне - 0.00-0.01%, в нефтезагрязненных почвах - в диапазоне 0.00-0.06%, причем в более загрязненных почвах таких генов было меньше. Процентное содержание генов группы аШП в незагрязненных почвах было на уровне 0.00-0,002%, в нефтезагрязненных - 0.04-9.85%. Относительное содержание генов группы а1кШ в незагрязненной почве установлено на уровне 0.75-4.23%, в загрязненной - 1.50-26.50%. На рис. 3 представлены данные о разбросе значений и зависимости содержания катаболических генов от типа почвы, уровня загрязненности нефтепродуктами и длительности эксперимента.

Рис. 3. Количество генов, кодирующих алкан-монооксигеназы (а, б, в - группа а1к1, г, д, е - группа а1к11, ж, з, и - группа а1кШ) в почвах различных типов с разными уровнями загрязнения на 0-е, 30-е, 60-е и 120-е сутки эксперимента. На вертикальной оси представлены значения количества копий генов, середина прямоугольника представляет собой среднее значение, прямоугольник - крайнее стандартное отклонение, а точки - экстремальные значения или выбросы

Максимальное количество генов группы а1к1 было характерно для незагрязненных почв. Для данной группы генов отмечена следующая закономерность - с появлением нефти и повышением ее концентрации количество генов уменьшается. Ранее несколько исследователей также отмечали отрицательную корреляцию количества генов, кодирующих алкан-монооксигеназы, с концентрацией нефти в почве [50, 51]. Для генов групп а1к11 и а1к111 наблюдается обратная зависимость: при увеличении концентрации нефти в образцах их количество увеличивалось. Так, на 3-е сутки после загрязнения количество генов группы а1к11 увеличилось во всех образцах в 2-435 раз в среднем, максимальные значения были отмечены на 30-е сутки. Количество генов группы а1к111 в нефтезагрязненных образцах также было выше, чем в незагрязненных, максимальные значения при этом отмечены для образцов НК.

Рис. 4. Количество генов, кодирующих деградацию ПАУ: а, б, в - гены группы ЦИРАН (грамотрицательные бактерии), г, д, е - гены группы GP-PAH (грамположительные бактерии) в почвах различных типов с разными уровнями загрязнения на 0-е, 30-е, 60-е и 120-е сутки эксперимента. Условные обозначения - как на рис. 3

В отличие от генов группы а1к11, количество генов группы а1кШ не изменилось сразу после загрязнения почвы нефтью, однако через 30 сут оно превышало таковое в незагрязненной почве в 1.5-3 раз; максимальное же количество генов а1кШ группы отмечено на 60-е сутки. Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными, показывающими повышение числа катаболических генов в загрязненных почвах по сравнению с незагрязненными [6, 52-54]. Можно также отметить, что для генов групп а1к1 и а1к11 не обнаружено различий в их количестве в зависимости от типа почв, тогда как для генов группы а1кШ можно отметить превышение количества генов в образцах дерново-подзолистых почв по сравнению с остальными типами почв.

Кроме того, нами была проведена оценка способности микробного сообщества к утилизации тяжелых фракций нефти, включающих полиароматические соединения. Результаты оценки количества генов, кодирующих способность микроорганизмов утилизировать ПАУ, представлены на рис. 4.

Табл. 3. Анализ направления и величины влияния факторов (содержание нефти, тип почв, день эксперимента), и их статистической значимости для степени деградации алканов, количества бактерий и катаболических генов, проводился с использованием линейных регрессионных моделей. Величины изменения даны по сравнению с контролем

* Значимые переменные, при Рг(> Г) < 0.05. М/А - не оценивали.

Количество генов группы О^РАН, кодирующих способность деградировать ПАУ у грамотрицательных бактерий, составило 0.01-0.03% от общего числа бактерий в незагрязненных почвах и 0.02-2.78% в загрязненных. Для генов группы ЦР-РАН (грамположительные бактерии) эти количества составили 0,49-1.08% и 0.03-1.36% соответственно.

Загрязнение вызвало различную динамику численности носителей генов, кодирующих деградацию ПАУ, у грамотрицательных и грамположительных бактерий. Так, наименьшее количество генов GN-PAH было обнаружено в незагрязненной почве, загрязнение же привело к значительному увеличению их количества вне зависимости от концентрации нефтепродуктов. Интересно, что непосредственно после загрязнения количество генов группы GN-PAH существенно не изменилось, однако к 30-м суткам достигло своего максимума в большинстве образцов кроме ДП с концентрацией 120 г/кг и ЧТ с концентрацией 250 г/кг.

В образцах, относящихся к чернозему типичному, обнаружено превышение количества генов данной группы над образцами других типов почв. Для группы ОР-РАН отмечена обратная корреляция между их количеством и уровнем загрязнения почвы нефтепродуктами, так, максимальные значения характерны для незагрязненных почв, тогда как на 3-е сутки после загрязнения их количество снижается в 2-11 раз. Количество генов указанной группы постепенно снижалось в течение эксперимента. Минимальное количество генов этой группы отмечено для образцов, относящихся к чернозему типичному. Различия в динамике количеств катаболических генов, кодирующих синтез диоксигеназ, в грамотрицательных и грамотрицательных бактериях можно объяснить разными скоростями роста микроорганизмов этих групп.

В работах [39, 55] отмечено, что в почвах с недавним загрязнением доминируют представители грамотрицательных бактерий, являющихся г-стратегами, тогда как представители грамположительных бактерий являются ^-стратегами, потребляющими более устойчивые углеводороды в почвах со старым загрязнением.

На заключительном этапе работы была проведена статистическая обработка полученных результатов с использованием моделей, оценивающих значимость факторов, влияющих на степень деградации алканов, численность бактерий, а также на количество генов, кодирующих деградацию углеводородов (табл. 3). Для количества бактерий и катаболических генов для моделирования использовался логарифм зависимой переменной, для степени деградации алканов - значение зависимой переменной.

Согласно анализу полученных данных выявлено, что суммарное содержание нефти является значимым фактором для содержания алканов, тогда как тип почв не является.

Для численности бактерий значимыми факторами являются содержание нефти и тип почв, не является длительность эксперимента. При этом установлена отрицательная корреляция между численностью бактерий и содержанием нефти. Для типа почв чернозем типичный также установлена отрицательная корреляция по сравнению с численностью в дерново-подзолистых почвах. Можно отметить, что различия в численности бактерий для серой лесной и дерново-подзолистой почвы незначимы.

Установлено, что для большинства групп генов содержание нефти является значимым фактором. Так, для генов групп alkl и GP -PAH выявлена отрицательная корреляция в зависимости от уровня загрязнения, а для групп alkII, GN-PAH - положительная. Для генов группы alkIII значимость этого фактора не установлена. Установлено, что тип почв является значимым фактором для генов групп alkIII и GP-PAH, при этом минимальное количество генов данных групп отмечено для образцов, относящихся к чернозему типичному. Для генов групп alkl, alkII и GN-PAH тип почвы не является значимым фактором. Выявлено, что длительность эксперимента является значимым фактором по отношению к большинству исследованных генов (alkl, alkIII, GN-PAH, GP-PAH), при этом для генов групп alkI и GP-PAH выявлена отрицательная корреляция количества генов и дней эксперимента, а для генов alkIII и GN -PAH - положительная. Для генов группы alkII значимость длительности эксперимента не установлена.

Таким образом, полученные уровни значимости подтверждают описанные ранее результаты. Для большинства генов значимым факторами оказались содержание нефти в почве (группы генов alkI, alkII, GN-PAH, GP-PAH), а также длительность эксперимента (группы генов alkI, alkIII, GN-PAH, GP-PAH). Подтверждается также отрицательная корреляция для общей численности бактерий и количества генов групп alkI и GP-PAH и положительная для остальных генов в зависимости от уровня загрязнения и длительности эксперимента. Значимое влияние типа почв установлено для количества бактерий и генов групп alkIII и GP-PAH, при этом минимальное количество генов отмечено для образцов чернозема типичного. На количество остальных генов тип почвы не оказывает влияние.

нефтепродукт ген деструкция почва

Заключение

В целом можно заключить, что общая численность бактериальных организмов в нефтезагрязненных почвах ниже по сравнению с незагрязненной почвой. Количество генов групп alkI и GP-PAH уменьшается при повышении степени загрязнения почвы нефтепродуктами и при увеличении длительности воздействия нефтяного загрязнения.