Статья: Окислительный гомеостаз прорастающих семян пшеницы в зависимости от продолжительности ультразвукового воздействия

Окислительный гомеостаз прорастающих семян пшеницы в зависимости от продолжительности ультразвукового воздействия

С.С. Тарасов, А.П. Веселов

Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н. И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия

Аннотация

Актуальность и цели. Ультразвук активно используется для воздействия на живые организмы, однако его физиологическое действие остается не до конца исследованным. В связи со способностью ультразвуковой волны генерировать в водной среде активные формы кислорода особое внимание, с нашей точки зрения, стоит уделить окислительному гомеостазу и первичному протеолизу запасного питательного вещества у прорастающих семян. В качестве основного показателя стоит выделить окислительную модификацию белков (ОМБ), так как именно они являются основными ловушками биорадикалов, но при этом их оборот в растительных тканях остается не исследованным. Целью работы явилось изучить влияние разного времени ультразвукового воздействия на уровень ОМБ, перекисного окисления липидов (ПОЛ), активности цистеиновой протеиназы и экспрессии ее гена (СР) в прорастающих семенах пшеницы. Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали семена пшеницы (Triticum aestivum L.), сорта «Экада - 70» 2018 г. сбора. Семена помещали в водную среду ультразвуковой ванны «УНИТРА - УНИМА» УМ - 4. Обработку проводили в течение 5, 10 и 20 мин, контролем служили семена, замоченные, но не обработанные ультразвуком. По окончании в семенах определяли уровень ПОЛ путем определения концентрации малоновогодиальдегида (МДА), ОМБ регистрации 2,4 - денитрофенилгидразонов (2,4 - ДНФГ), активности цистеиновой протеиназы и экспрессии гена (СР). Результаты. Эксперименты выявили зависимость исследуемых показателей от времени ультразвукового воздействия. Показано увеличение содержания МДА в прорастающих семенах пшеницы после ультразвукового воздействия. Содержание 2,4 - ДНФГ имело волнообразную динамику, статистически значимо не изменялось в прорастающих семенах, подверженных ультразвуковому воздействию в течение 5 мин, увеличивалось в образцах, на которые воздействовали ультразвуком в течение 10 мин, и снижалось в семенах, обработанных ультразвуком в течение 20 мин. Активность исследуемой протеиназы была выше в образцах после пятиминутной ультразвуковой обработки и ниже контрольных значений в семенах после 20 мин действия ультразвуком. Экспрессия гена (СР) была выше в прорастающих семенах, подверженных пяти- и десятиминутной ультразвуковой обработке, с последующим падением ниже контроля. Выводы. Установлено усиление процессов ПОЛ, волнообразная динамика ОМБ и первичная активация протеолиза с последующим ингибированием в прорастающих семенах пшеницы после ультразвукового воздействия, гомеостаз белков более толерантен к действию АФК по сравнению с липидами.

Ключевые слова: окислительная модификация белков, перекисное окисление липидов, цистеиновые протеиназы, семена пшеницы, прорастание семян, ультразвук

Abstract

Oxidative homeostasis of germinating wheat seeds depending on the ultrasonic effect's duration

S.S. Tarasov, A.P. VeseloV

Nizhny Novgorod State Agricultural Academy, Nizhny Novgorod, Russia Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russia

Background. Ultrasound is actively used to influence living organisms, but its physiological effect remains not fully understoodIn connection with the ability of ultrasonic waves to generate reactive oxygen species in an aqueous medium, special attention, from our point of view, should be paid to oxidative homeostasis and primary proteolysis of a reserve nutrient in germinating seeds. As the main indicators, attention should be paid to the proteins' oxidative modification (POM), since they are the main traps of bioradicals, but their turnover in plant tissues remains unexplored. The purpose of the research is to study the effect of different times of ultrasonic exposure on the level of POM, lipid peroxidation (LPO), cysteine proteinase activity and expression of its gene (CP) in germinating wheat seeds. Materials and methods. Wheat seeds (Triticum aestivum L.), “Ekada-70” variety, collected in 2018, were used as the object of the study. The seeds were placed in an aqueous medium of an ultrasonic bath “UNITRA - UNIMA” UM - 4. The treatment was carried out for 5, 10, and 20 minutes; seeds soaked but not sonicated served as a control. At the end, the level of lipid peroxidation was determined in the seeds by the level of malonic dialdehyde (MDA) concentration, OMB registration of 2,4 - denitrophenylhydrazones (2,4 - DNPH), cysteine proteinase activity and gene expression (CP). Results. The experiments revealed the dependence of the studied parameters on the time of ultrasonic exposure. An increase in MDA content in germinating wheat seeds was shown after ultrasonic exposure. The content of 2,4 - DNPH had a wave-like dynamics, did not statistically significantly change in germinating seeds exposed to ultrasound for 5 min, increased in samples that were exposed to ultrasound for 10 min, and decreased in seeds treated with ultrasound for 20 minutes. The activity of the studied proteinase was higher in the samples after 5 minutes of ultrasonic treatment and lower than the control values in the seeds after 20 minutes of sonication. Gene expression (SR) was higher in germinating seeds subjected to 5-10 minutes ultrasonic treatment, followed by a fall below the control. Conclusions. The intensification of LPO processes, the wave-like dynamics of POM and the primary activation of proteolysis with subsequent inhibition in germinating wheat seeds after ultrasound exposure were established; protein homeostasis is more tolerant to the action of ROS compared to lipids.

Keywords: oxidative modification of proteins, lipid peroxidation, cysteine proteinases, seeds of wheat, seed germination, ultrasound

Введение

Применению ультразвука уделяется большое внимание в современной науке и технике [1-3]. Его используют в медицине [4-5], пищевой и химической промышленности [6-11], в сельском хозяйстве [12-14]. Несмотря на активное применение в хозяйственной деятельности, его физиологическое действие на организм остается не до конца исследованным.

Особый интерес ультразвукового воздействия, с нашей точки зрения, лежит в изучении окислительного гомеостаза и первичного протеолиза запасного питательного вещества при прорастании семян. Так, в литературе отсутствует информация о влиянии ультразвука на перекисное окисление липидов (ПОЛ), окислительную модификацию белков (ОМБ), активность и экспрессию генов цистеиновых протеиназ (СР). Однако имеются данные о его воздействии на морфометрические показатели прорастающих семян [15-16], известна также способность ультразвука генерировать в водных растворах активные формы кислорода (АФК) [17], влиять на активность ферментов [18], экспрессию генов [19] и конформацию биомолекул [20]. При этом отмечается как активирующее влияние на ряд вышеуказанных процессов, так и ингибирующее. В связи с тем, что уровень окислительного гомеостаза зависит от степени генерации АФК и действия ряда ферментов [21], исследование содержания продуктов ПОЛ и ОМБ в прорастающих семенах является актуальной задачей современной физиологической науки.

Стоит также отметить, что в научной литературе отсутствует информация по обороту окисленных белков в растительных объектах и их взаимосвязи с уровнем ПОЛ и протеолизом запасного вещества, что также свидетельствует о важности и необходимости исследования данных процессов у растений. окислительный гомеостаз ультразвуковой пшеница

На основании вышеизложенного целью нашей работы явилось изучение влияния разных по времени ультразвукового воздействия на уровень ПОЛ, ОМБ, активности цистеиновой протеиназы и экспрессии ее гена в прорастающих семенах пшеницы.

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали семена пшеницы (Triti- cum aestivum L.) сорта «Экада - 70». Семена обрабатывали ультразвуком через 24 ч после замачивания. Исследуемые семена помещали в водную среду ультразвуковой ванны «УНИТРА - УНИМА» УМ - 4, мощность - 25 кГц. Обработку проводили в течение 5, 10 и 20 мин, контролем служили одновременно замоченные, но не обработанные ультразвуком семена. По окончании обработки в семенах регистрировали уровень ПОЛ путем определения концентрации МДА, ОМБ путем определения производных 2,4 - ДНФГ, активности кислой (рН - 4,5) цистеиновой протеиназы и экспрессии ее гена (СР). Определение содержания МДА проводили согласно методике, основанной на его способности реагировать с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием окрашенных производных [22]. Продукты ОМБ определяли по методике, основанной на способности окисленных белков взаимодействовать с 2,4 - ДНФГ [23], при этом метод был нами модифицирован применительно к растительным объектам. Растительный материал массой 1 г растирали в форфоровой ступке с 9 мл фосфатного буфера рН 7,2, полученный гомогенат центрифугировали 15 мин при 3000 g, а супернатант использовали для анализа. Активность протеиназ определяли по методике Ансона [24]. Экспрессию гена СР в прорастающих семенах определяли полуколичественно с помощью полимеразной цепной реакции по конечной точке, с последующей визуализацией в агарозном геле [25]. Для этого 0,05 г растительного материала гомогенизировали с использованием набора для выделения тотальной РНК (Extract RNA («Евроген», Россия). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали, используя набор для обратной транскрипции ОТ-1 с М-MLV обратной транскриптазой и со случайными гексануклеотидными (random) праймерами («Синтол», Россия). В качестве референсного гена использовался ген актина [26]. Подбор праймеров проводили по кодирующим участкам генов актина и СР в программе Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast) по аннотированным последовательностям AY841792.2 [27] и KC775780.1 [28]. Полученные праймеры представлены в табл. 1.

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров для проведения ПЦР в режиме реального времени

Количественную оценку ампликонов проводили путем анализа агарозного геля и выражали в условных единицах (отн. ед.) [29].

Полученные результаты концентраций продуктов окисления белков и липидов, активность фермента и относительное содержание транскриптов иРНК СР обрабатывали статистически, рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартные отклонения (о) с использованием программы Microsoft Excel 2010 [30].

Результаты исследования

Одним из основных продуктов ПОЛ является МДА, данный метаболит был зафиксирован в значительных количествах во всех исследуемых образцах. Наиболее низкое его содержание было отмечено в контрольных прорастающих семенах пшеницы, а в образцах, на которые действовали ультразвуком, отмечалось существенное увеличение содержания МДА (Р < 0,05) (рис. 1,й). Так, у прорастающих семян, подверженных 5-минутному воздействию ультразвуком, его содержание увеличивается вдвое, через десять минут действия ультразвуком существенных изменений, по сравнению с предыдущим измерением, не отмечается (Р > 0,05). Максимальное содержание МДА зафиксировано в семенах, подверженных 20-минутному ультразвуковому воздействию, что в три раза больше, чем в контрольных образцах (Р < 0,05).

Рис. 1. Содержание малонового диальдегида (а) и сумма всех продуктов окислительной модификации белков (б) в прорастающих семенах пшеницы в зависимости от времени ультразвукового воздействия, где ПК - контроль, П5, П10 и П20 - прорастающие семена, подверженные ультразвуковому воздействию в течение 5, 10 и 20 мин соответственно; *р < 0,05 относительно контроля по критерию Стьюдента; ** - достоверные различия в сравнении с контролем по критерию Крускала - Уоллиса

Динамика содержания продуктом ОМБ отличается от таковой продуктов ПОЛ. Содержание окисленных белковых метаболитов в образцах, на которые воздействовали ультразвуком в течение 5 мин, не отличается от контроля (Р > 0,05). Десятиминутное воздействие исследуемым нами фактором показало увеличение содержания продуктов ОМБ примерно на треть по сравнению с контролем (Р < 0,05). Уровень ОМБ в прорастающих семенах пшеницы, на которые действовали ультразвуком в течение 20 мин, оказался ниже даже по сравнению с контрольными образцами (рис. 1,б).

Анализ фракционного состава исследуемых нами продуктов ОМБ выявил преобладание альдегид и кетон-денитрофенилгидразонов нейтрального характера, при этом не наблюдалось преобладание какого-либо из этих продуктов. Содержание же алифатических альдегид и кетон-денитрофенилгидразонов основного характера ниже, чем таковых нейтрального характера. Стоит также отметить явное преобладание по содержанию альдегид-денит- рофенилгидразонов по сравнению с кетон-денитрофенилгидразонами (рис. 2).

Анализируя динамику содержания продуктов ПОЛ и ОБМ, отметим ее независимость относительно времени ультразвукового воздействия. Статистически значимые изменения содержания МДА были зафиксированы уже в образцах после пятиминутного ультразвукового воздействия, а содержание 2.4 - денитрофенилгидразонов начинало отличаться от контрольных значений только после десятиминутного действия ультразвуком. Долговременная, двадцатиминутная обработка ультразвуком существенно усиливала образование и накопление МДА, но снизила содержание продуктов ОМБ.

Известно, что в обороте окисленных белков важную роль играет протеолитический комплекс [31-33]. Поэтому, изучая уровень окислительного гомеостаза, стоит уделять внимание распаду окисленных метаболитов. Показательно влияние ультразвука на активность тиоловых протеиназ в прорастающих семенах пшеницы (рис. 3,а). Выявлено стимулирующее кратковременное действие на активность исследуемой протеиназы ультразвуком (в течение 5 мин). Последующее воздействие постепенно снижало активность цистеиновых протеиназ. Действие в течение 10 мин приводило к падению активности исследуемого нами фермента до уровня контроля, а двадцатиминутное воздействие снижало ее примерно на треть по сравнению с контролем.

Рис. 2. Фракционный состав 2,4 - денитрофенилгидразонов - продуктов окислительной модификации белков в прорастающих семенах пшеницы в зависимости от времени ультразвукового воздействия:

АН - алифатические альдегид-денитрофенилгидразоны нейтрального характера;

АО - алифатические альдегид-денитрофенилгидразоны основного характера; КН - алифатические кетон-денитрофенилгидразоны нейтрального характера;

КО - алифатические кетон-денитрофенилгидразоны основного характера, другие обозначения такие же, как и на рис. 1

Рис. 3. Активность цистеиновых протеиназ (а) и экспрессия гена СР (б) в прорастающих семенах гороха в зависимости от времени ультразвукового воздействия (обозначения такие же, как и на рис. 1)