Полученные данные о накоплении транскрипта иРНК гена СР показывают его зависимость от ультразвукового воздействия (рис. 3,б). Установлено увеличение содержания транскрипта иРНК гена СР в прорастающих семенах пшеницы при 5-минутном ультразвуковом воздействии (Р < 0,05). При дальнейшем действии ультразвуком на прорастающие семена пшеницы экспрессия гена СР была остановлена, что проявилось в отсутствии увеличения иРНК в образцах. В семенах, на которые воздействовали ультразвуком в течение 20 мин содержание транскриптом иРНК гена СР становится ниже относительно других опытных образцов.
Обсуждение результатов
Усиление процессов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в прорастающих семенах пшеницы после ультразвукового воздействия, вероятно, связано с генерацией активных форм кислорода под действием ультразвука [34-37]. Например, при исследовании ультразвуковых сенсибилизаторов, которые использовали для борьбы с раковыми клетками, показана чувствительность порфирина к ультразвуку в зависимости от присутствующего иона металла, причем порфирин Zn (II) и Pd (II) является наиболее эффективным в образовании синглетного кислорода и гидроксильных радикалов [38]. Было также обнаружено, что разложение протопорфирина IX одновременно сопровождается образованием ОН с увеличением выходной мощности ультразвукового генератора [39], способность ультразвука генерировать NO-группы из L-аргинина [40].
Снижение содержания окисленных белков, вероятно, связано с синергетическим эффектом действия ультразвука на саму белковую молекулу, а также на протеолитические ферменты. По-видимому, активируется процесс протеолиза запасного вещества, что в итоге ускоряет и процесс деградации окисленных белков.
Как видно по результатам нашего эксперимента, гомеостаз белков более толерантен к действию АФК по сравнению с липидами. Вероятно, это связано с тем, что в прорастающих семенах пшеницы содержание белков и ферментов, участвующих в их метаболизме, существенно выше по сравнению с липидами [41-42]. Другой возможной причиной устойчивого белкового окислительного гомеостаза по сравнению с липидным у суточных прорастающих семян пшеницы является то, что большая часть белков находится в покоящемся состоянии, а липиды почти полностью задействованы в мета-болизме [43-44].
Активация цистеиновых протеиназ в прорастающих семенах пшеницы, подверженных 5-минутному воздействию ультразвуком, вероятно, связана с увеличением общей доступности белкового субстрата для исследуемого фермента. Падение активности фермента связано с действием АФК на его структуру, в том числе нарушением целостности, дезактивацией активных центров путем окисления некоторых, входящих в их состав аминокислот.
Усиление уровня экспрессии гена СР в образах после 5-минутной ультразвуковой обработки, возможно, происходит в связи с денатурирующим действием ультразвуковой волны, связанным с разрушением водородных связей между азотистыми основаниями, что, по сути, приводит к формированию транскрипционных пузырей, это позволяет ускорить работу ДНК зависимой РНК полимеразы, тем самым увеличить скорость считывания информации с исследуемого гена. Долговременное ультразвуковое воздействие, напротив, снижает уровень экспрессии гена СР, что, вероятно, происходит из-за нарушения целостности первичной структуры ДНК в результате механического разурешения фосфодиэфирных связей и окисления нуклеотидов в составе ДНК. Кроме этого, происходит дезактивация ферментов транскрипции за счет повышенной генерации АФК.
Заключение
1. Показано большее содержание малонового диальдегида (МДА) в прорастающих семенах пшеницы, подверженных ультразвуковому воздействию. Содержание 2,4 - ДНФГ изменялось статистически незначимо в прорастающих семенах, подверженных ультразвуковому воздействию в течение 5 мин, достоверно увеличивалось в образцах, на которые воздействовали ультразвуком в течение 10 мин и достоверно снижалось в семенах, обработанных ультразвуком в течение 20 мин.
2. Активность цистеиновых протеиназ увеличивалась после 5-минутной обработки ультразвуком с последующим падением в динамике и снижалась ниже уровня в образцах, на которые воздействовали ультразвуком в течение 20 мин.
3. В прорастающих семенах пшеницы, подверженных 5-минутному ультразвуковому воздействию, достоверно показано усиление экспрессии гена СР, с последующей почти полной остановкой транскрипции, что проявлялось в отсутствии накопления иРНК гена СР в семенах, на которые воздействовали ультразвуком в течение 10 мин, и снижением транскриптов в образцах после 20-минутной обработки.
Список литературы
1. Maresca D., Lakshmanan A., Abedi M. [et al.]. Biomolecular Ultrasound and Sonogenetics // Annu Rev Chem Biomol Eng. 2018. Vol. 7, T. 9. P. 229-252. URL: https:// doi:10.1146/annurev-chembioeng-060817-084034
2. Naeve I., Mommens M., Arukwe A., Kjorsvik E. Ultrasound as a noninvasive tool for monitoring reproductive physiology in female Atlantic salmon (Salmo salar) // Physiol Rep. 2018. Vol. 6, T. 9. P. 136-140. URL: https://doi:10.14814/phy2.13640
3. Chen L. D., Ruan S. M., Lin Y. [et al.]. Comparison between M-score and LR-M in the reporting system of contrast-enhanced ultrasound LI-RADS // Eur Radiol. 2019. Vol. 29, T. 8. P. 4249-4257. URL: https://dof10.1007/s00330-018-5927-8
4. Methachan B., Thanapprapasr K. Polymer-Based Materials in Cancer Treatment: From Therapeutic Carrier and Ultrasound Contrast Agent to Theranostic Applications // Ultrasound Med Biol. 2017. Vol. 43, T. 1. P. 69-82. URL: https://doi:10.1016/j.ultrasmed bio.2016.09.009
5. Zhou L. Q., Li P., Cui X. W., Dietrich C. F. Ultrasound nanotheranostics in fighting cancer: Advances and prospects // Cancer Lett. 2020. Vol. 1, T. 470. P. 204-219. URL: https://doi:10.1016/j.canlet.2019.11.034
6. Hu A., Zheng J., Qiu T. Industrial experiments for the application of ultrasound on scale control in the Chinese sugar industry // Ultrason Sonochem. 2006. Vol. 13, T. 4. P. 329-333. URL: https://doi:10.1016/j.ultsonch.2005.05.005
7. Alarcon-Rojo A. D., Janacua H., Rodriguez J. C. [et al.]. Power ultrasound in meat processing // Meat Sci. 2015. Vol. 107. P. 86-93. URL: https://doi:10.1016/j.meatsci. 2015.04.015
8. Arvanitoyannis I. S., Kotsanopoulos K. V., Savva A. G. Use of ultrasounds in the food industry-Methods and effects on quality, safety, and organoleptic characteristics of foods // Crit Rev Food Sci Nutr. 2017. Vol. 57, T. 9. P. 109-128. URL: https://doi:10. 1080/10408398.2013.860514
9. Gallo M., Ferrara L., Naviglio D. Application of Ultrasound in Food Science and Technology: A Perspective // Foods. 2018. Vol. 7, Iss. 10. URL: https://doi:10.3390/foods 7100164
10. Kiss A. A., Geertman R., Wierschem M. [et al.]. Ultrasound-assisted emerging technologies for chemical processes // Chem Technol Biotechnol. 2018. Vol. 93, Iss. 5. P. 1219-1227. URL: https://doi:10.1002/jctb.5555
11. Bera S., Mondal D. A role for ultrasound in the fabrication of carbohydrate-supported nanomaterials // Ultrasound. 2019. Vol. 22, № 2. P. 131-156. URL: https://doi:10.1007/ s40477-019-00363-8
12. Ribeiro F. R., Tedeschi L. O. Using real-time ultrasound and carcass measurements to estimate total internal fat in beef cattle over different breed types and managements // Anim Sci. 2012. Vol. 90, T. 9. P. 3259-3265. URL: https://doi:10.2527/jas.2011-4697
13. Stouffer J. R. History of ultrasound in animal science // Ultrasound Med. 2004. Vol. 23 (5). P. 577-584. URL: https://doi:10.7863/jum.2004.23.5.577
14. Hasan M. M., Bashir T., Bae H. Use of Ultrasonication Technology for the Increased Production of Plant Secondary Metabolites // Molecules. 2017. Vol. 22, Iss. 7. P. 1046. URL: https://doi:10.3390/molecules22071046
15. Ding J., Johnson J., Chu Y. F., Feng H. Enhancement of y-aminobutyric acid, avenanth- ramides, and other health-promoting metabolites in germinating oats (Avena sativa L.) treated with and without power ultrasound // Food Chemistry. 2019. Vol. 283. P. 239-247. URL: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.12.136
16. Miano A. C., Sabadoti V. D., Augusto P. E. D. Combining Ionizing Irradiation and Ultrasound Technologies: Effect on Beans Hydration and Germination // Food Sci. 2019. Vol. 84 (11). P. 3179-3185. URL: https://doi.org/10.1111/1750-3841.14819
17. Okada K., Kudo N., Hassan M. A. [et al.]. Threshold curves obtained under various gaseous conditions for free radical generation by burst ultrasound - Effects of dissolved gas, microbubbles and gas transport from the air // Ultrason Sonochem. 2009. Vol. 16, № 4. P. 512-618. URL: https://doi:10.1016/j.ultsonch.2008.11.010
18. Gebicka L., Gebicki J. L. The effect of ultrasound on heme enzymes in aqueous solution // Enzyme Inhib. 1997. Vol. 12, T. 2. P. 133-141. URL: https://doi:10.3109/1475636 9709035814
19. Ogawa R., Watanabe A., Morii A. Ultrasound up-regulates expression of heme oxyge- nase-1 gene in endothelial cells // Med Ultrason. 2015. Vol. 42, Iss. 4. P. 467-475. URL: https://doi:10.1007/s10396-015-0635-3
20. Jiang Z., Yao K., Yuan X. [et al.]. Effects of ultrasound treatment on physico-chemical, functional properties and antioxidant activity of whey protein isolate in the presence of calcium lactate // Sci Food Agric. 2018. Vol. 98, Iss. 4. P. 1522-1529.
21. Davies M. J. Protein oxidation and peroxidation // Biochem. 2016. Vol. 473, Iss. 7. P. 805-825. URL: https://doi:10.1042/BJ20151227
22. Стальная И. Д., Гаришвили Т. Г. Метод определения малоновогодиальдегида // Современные методы в биохимии. М. : Медицина, 1977. C. 66-68.
23. Дубинина Е. Е. [и др.]. Окислительные модификации белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. 1995. Т. 41, № 1. С. 24-26.
24. Александрова И. Ф., Веселов А. П., Ефременко Ю. Р. Протеолитическая активность прорастающих семян пшеницы при тепловом стрессе // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 1. С. 223.
25. Gal A. B., Carnwath J. W., Dinnyes A. [et al.]. Comparison of real-time polymerase chain reaction and end-point polymerase chain reaction for the analysis of gene expression in preimplantation embryos // Reprod Fertil Dev. 2006. Vol. 18, № 3. P. 365-371. doi:10.1071/rd05012
26. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. Вл. В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А. Романова. М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. 487 с.
27. Patent CH (200410088515/8)-B 08-NOV-2004 A Triticum aestivum Cysteine Proteinase Gene and Its Utilization / Jing R., Zang Q., Guo Z., Chang X. ; Chinese Academy of Agricultural Sciences ; Institute of Crop Germplasm Resources.
28. Lu S. Zn2+ blocks annealing of complementary single-stranded DNA in a sequence- selective manner // Sci Rep. 2014. Vol. 4. P. 5464. URL: https://doi:10.1038/srep05464
29. Schmittgen T. D., Zakrajsek B. A., Mills A. G. [et al.]. Quantitative reverse transcrip- tion-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and realtime methods // Anal Biochem. 2000. Vol. 285, Iss. 2. P. 194-204. doi:10.1006/ abio.2000.4753
30. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М. : Практика, 1999. 459 с.
31. Дубинина Е. Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. СПб., 2006. 396 с.
32. Jung T., Hohn A., Grune T. The proteasome and the degradation of oxidized proteins: Part II - protein oxidation and proteasomal degradation // Redox Biol. 2014. Vol. 2. P. 99-104. URL: https://doi:10.1016/j.redox.2013.12.008
33. Raynes R., Pomatto L. C., Davies K. J. Degradation of oxidized proteins by the proteasome: Distinguishing between the 20S, 26S, and immunoproteasome proteolytic pathways // Mol Aspects Med. 2016. Vol. 50. P. 41-55. URL: https://doi:10.1016/j.mam. 2016.05.001
34. He L. L., Wang X., Wu X. X. [et al.]. Protein damage and reactive oxygen species generation induced by the synergistic effects of ultrasound and methylene blue // Spectro- chim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 2015. Vol. 134. P. 361-366. URL: https://doi:10. 1016/j.saa.2014.06.121
35. Duco W., Grosso V., Zaccari D., Soltermann A. T. Generation of ROS mediated by mechanical waves (ultrasound) and its possible applications // Methods. 2016. Vol. 109. P. 141-148. URL: https://doi:10.1016/j.ymeth.2016.07.015
36. Jia C., Xu L., Han T. [et al.]. Generation of Reactive Oxygen Species in Heterogeneously Sonoporated Cells by Microbubbles with Single-Pulse Ultrasound // Ultrasound Med Biol. 2018. Vol. 44, № 5. P. 1074-1085. URL: https://doi:10.1016/j.ultrasmedbio.2018. 01.006
37. Escoffre J. M., Campomanes P., Tarek M., Bouakaz A. New insights on the role of ROS in the mechanisms of sonoporation-mediated gene delivery // Ultrason Sonochem. 2020. Vol. 64. P. 1049-1098. URL: https://doi:10.1016/j.ultsonch.2020.104998
38. Giuntini F., Foglietta F., Marucco A. M. [et al.]. Insight into ultrasound-mediated reactive oxygen species generation by various metal-porphyrin complexes // Free Radic Biol Med. 2018. Vol. 121. P. 190-201. URL: https://doi:10.1016/j.freeradbiomed.2018. 05.002
39. Wang P., Wang X., Zhang K. [et al.]. The spectroscopy analyses of PpIX by ultrasound irradiation and its sonotoxicity in vitro // Ultrasonics. 2013. Vol. 53, Iss. 5. P. 935-942. URL: https://doi:10.1016/j.ultras.2012.10.019
40. Zhang K., Xu H., Jia X. [et al.]. Ultrasound-Triggered Nitric Oxide Release Platform Based on Energy Transformation for Targeted Inhibition of Pancreatic Tumor // ACS Nano. 2016. Vol. 10, Iss. 12. P. 10 816-10 828. URL: https://doi:10.1021/acsnano. 6b04921
41. Lane B. G. Cellular desiccation and hydration: developmentally regulated proteins, and the maturation and germination of seed embryos // FASEB. 1991. Vol. 5, № 14. P. 2893-2901. URL: https://doi:10.1096/fasebj.5.14.175235
42. Liu Y., Han C., Deng X. [et al.]. Integrated physiology and proteome analysis of embryo and endosperm highlights complex metabolic networks involved in seed germination in wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Physiol. 2018. Vol. 229. P. 63-76. URL: https://doi:10.1016/j.jplph.2018.06.011
43. Yadav S. P., Ahuja V. P., Das H. K. Changes in amino acid composition of proteins in developing wheat embryo during seed germination // Indian J. Biochem Biophys. 1972. Vol. 9, № 4. P. 350-351.
44. Lowe L. B., Ries S. K. Endosperm protein of wheat seed as a determinant of seedling growth // Plant Physiol. 1973. Vol. 51, № 1. P. 57-60. URL: https://doi:10.1104/ pp.51.1.57
References
1. Maresca D., Lakshmanan A., Abedi M. [et al.]. Biomolecular Ultrasound and Sonogenetics. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2018;7(9):229-252. Available at: https://doi:10. 1146/annurev-chembioeng-060817-084034
2. Naeve I., Mommens M., Arukwe A., Kjorsvik E. Ultrasound as a noninvasive tool for monitoring reproductive physiology in female Atlantic salmon (Salmo salar). Physiol Rep. 2018;6(9):136-140. Available at: https://doi:10.14814/phy2.13640
3. Chen L.D., Ruan S.M., Lin Y. [et al.]. Comparison between M-score and LR-M in the reporting system of contrast-enhanced ultrasound LI-RADS. Eur Radiol. 2019;29(8): 4249-4257. Available at: https://doi:10.1007/s00330-018-5927-8
4. Methachan B., Thanapprapasr K. Polymer-Based Materials in Cancer Treatment: From Therapeutic Carrier and Ultrasound Contrast Agent to Theranostic Applications. Ultrasound Med Biol. 2017;43(1):69-82. Available at: https://doi:10.1016/j.ultrasmedbio. 2016.09.009
5. Zhou L.Q., Li P., Cui X.W., Dietrich C.F. Ultrasound nanotheranostics in fighting cancer: Advances and prospects. Cancer Lett. 2020;1(470):204-219. Available at: https:// doi:10.1016/j.canlet.2019.11.034
6. Hu A., Zheng J., Qiu T. Industrial experiments for the application of ultrasound on scale control in the Chinese sugar industry. Ultrason Sonochem. 2006;13(4):329-333. Available at: https://doi:10.1016/j.ultsonch.2005.05.005
7. Alarcon-Rojo A.D., Janacua H., Rodriguez J.C. [et al.]. Power ultrasound in meat processing. Meat Sci. 2015;107:86-93. Available at: https://doi:10.1016/j.meatsci.2015. 04.015
8. Arvanitoyannis I.S., Kotsanopoulos K.V., Savva A.G. Use of ultrasounds in the food industry-Methods and effects on quality, safety, and organoleptic characteristics of foods. Crit Rev Food Sci Nutr. 2017;57(9):109-128. Available at: https://doi: 10.1080/ 10408398.2013.860514
9. Gallo M., Ferrara L., Naviglio D. Application of Ultrasound in Food Science and Technology: A Perspective. Foods. 2018;7(10). Available at: https://doi:10.3390/foods 7100164
10. Kiss A.A., Geertman R., Wierschem M. [et al.]. Ultrasound-assisted emerging technologies for chemical processes. Chem Technol Biotechnol. 2018;93(5):1219-1227. Available at: https://doi:10.1002/jctb.5555
11. Bera S., Mondal D. A role for ultrasound in the fabrication of carbohydrate-supported nanomaterials. Ultrasound. 2019;22(2): 131-156. Available at: https://doi:10.1007/ s40477-019-00363-8
12. Ribeiro F.R., Tedeschi L.O. Using real-time ultrasound and carcass measurements to estimate total internal fat in beef cattle over different breed types and managements. Anim Sci. 2012;90(9):3259-3265. Available at: https://doi:10.2527/jas.2011-4697
13. Stouffer J.R. History of ultrasound in animal science. Ultrasound Med. 2004;23(5): 577-584. Available at: https://doi:10.7863/jum.2004.23.5.577
14. Hasan M.M., Bashir T., Bae H. Use of Ultrasonication Technology for the Increased Production of Plant Secondary Metabolites. Molecules. 2017;22(7): 1046. Available at: https://doi:10.3390/molecules22071046
15. Ding J., Johnson J., Chu Y.F., Feng H. Enhancement of y-aminobutyric acid, avenan- thramides, and other health-promoting metabolites in germinating oats (Avena sativa L.) treated with and without power ultrasound. Food Chemistry. 2019;283:239-247. Available at: https://doi.org/10.1016/_j.foodchem.2018.12.136
16. Miano A.C., Sabadoti V.D., Augusto P.E.D. Combining Ionizing Irradiation and Ultrasound Technologies: Effect on Beans Hydration and Germination. Food Sci. 2019; 84(11):3179-3185. Available at: https://doi.org/10.1111/1750-3841.14819
17. Okada K., Kudo N., Hassan M.A. [et al.]. Threshold curves obtained under various gaseous conditions for free radical generation by burst ultrasound - Effects of dissolved gas, microbubbles and gas transport from the air. Ultrason Sonochem. 2009;16(4): 512-618. Available at: https://doi:10.1016/j.ultsonch.2008.11.010
18. Gebicka L., Gebicki J.L. The effect of ultrasound on heme enzymes in aqueous solution. Enzyme Inhib. 1997;12(2):133-141. Available at: https://doi:10.3109/1475636970 9035814
19. Ogawa R., Watanabe A., Morii A. Ultrasound up-regulates expression of heme oxyge- nase-1 gene in endothelial cells. Med Ultrason. 2015;42(4):467-475. Available at: https://doi:10.1007/s10396-015-0635-3