Материал: Орлов-ВЭЖХ

30

На сорбентах С18 выполняются такие популярные анализы, как определение полиядерных ароматических углеводородов (бенз-а-пирен, хризен, пирен, антрацен и т.д.), ароматики (бензол, толуол, ксилолы и т.д.), фенолов ( фенол, хлорфенолы, нитрофенолы ...), микотоксинов (афлатоксины, охратоксин, зеараленон, патулин), триазиновых гербицидов, карбаматных пестицидов, антибиотиков, наркотических веществ ....

Кроме силикагелей С18 в хроматографии используют силикагели с привитыми циано- (СN) и амино- (NH2) группами. Эти фазы нашли широкое применение в биологии, медицине, биохимии, фармакологии и др.

11.3. Ионная хроматография

Ионная хроматография - это метод основанный на ионообменном разделении органических и неорганических ионов с последующим кондуктометрическим детектированием.

Двухколоночная ионная хроматография - метод, представляющий собой сочетание ионообменной хроматографии с детектированием по электропроводности и компенсацией электропроводящего фона элюента.

Элюенты, используемые при ионообменных разделениях, содержат сильные электролиты и обладают высокой электропроводностью. Ионная хроматография с подавлением фона основана на использовании второй ионной колонки, названной подавительной (компенсационной), стоящей после разделительной. Эта вторая колонка превращает элюент в раствор с низкой электропроводностью после того, как произошло разделение компонентов пробы. Срок службы подавительной колонки ограничен так, как происходит ее насыщение ионами элюента. После насыщения колонка может быть восстановлена 0.5-1.0 моль/л раствором NaOH для анионообменника и 0.5-1.0 моль/л раствором HNO3 для катионообменника, после чего промыта дистиллированной водой. Срок службы подавительной колонки 8-10 часов, время регенерации 0.5 часа.

Разделение анионов.

На рис. 29 показана схема разделения анионов, реализованная на ионном хроматографе Цвет-3006М . Разделительная колонка низкой емкости обеспечивает высокоэффективное разделение ионных групп. Анионы пробы и элюента конкурируют за фиксированные активные центры смолы. Группы с более высоким сродством к смоле будут удерживаться на колонке дольше. Наиболее распространенные элюенты для разделения анионов смеси - NaHCO3, Na2CO3.

В подавительной колонке идет ряд реакций. Анионы элюента реагируют со смолой:

(SO3--H+)+NaHCO3→(SO3-+Na+)+H2CO3, 2(SO3-- H+)+Na2CO3→2(SO3-+Na+)+H2CO3.

В каждом случае катион натрия обменивается с протонами смолы подавительной колонки. В результате элюирующий анион превращается в группы с низкой электропроводностью H2CO3.

Рис29.

Элюент из насоса

3мМ Na2CO3 , 2.4мМ NaНСО3

Ввод пробы: F-, Cl-, NO-, PO43-, SO42-

Разделительная колонка

31

-N+HCO3-+Na+Cl-= -N+Cl-+Na+HCO3-

-SO3-H++Na+HCO3-→ -SO3-Na++H2CO3

-SO3-H++Na+Cl-→ -SO3-Na++H+Cl-

Детектор

H+Cl-

XII. ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ.

12.1. Элюирующая сила и эффективность.

Подвижная фаза в ЖХ выполняет двоякую функцию: с одной стороны, она обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке. С этой точки зрения химические свойства подвижной фазы не играют существенной роли, более важны их физические свойства - вязкость, летучесть. С другой стороны, подвижная фаза в ЖХ играет активную химическую, по существу, роль. Молекулы подвижной фазы взаимодействуют с другими компонентами системы: молекулами разделяемых веществ и молекулами неподвижной фазы. Поэтому вторая и более важная функция подвижной фазы сводится к регулированию констант равновесия, к регулированию удерживания. Возможности регулирования удерживания с помощью подвижной фазы необычайно велики. Нередко, заменой одного растворителя на другой, можно изменить коэффициент емкости К’ в 1000-10000 раз, однако для практической хроматографии пригоден лишь довольно узкий диапазон величин К’ - примерно 1 - 20. Слишком малые значения К’ непригодны, т.к. в этой области резко возрастает вероятность взаимного перекрытия пиков. Наоборот, если К’ слишком велико, для разделения требуется слишком много времени, к тому же увеличивается риск не обнаружить более прочно сорбирующиеся компоненты смеси.

Таким образом, для решения каждой конкретной задачи состав как подвижной, так и неподвижной фазы должен быть тщательно подобран с точки зрения физических и химических свойств ее компонентов.

Основными характеристиками подвижных фаз являются их элюирующая сила и селективность.

Один из элюентов способен смыть с колонки лишь слабосвязанные сорбаты, другие же вызывают десорбцию почти любых молекул. Молекулы подвижной фазы могут взаимодействовать с молекулами разделяемых веществ. При этом образуются ассоциаты, которые взаимодействуют с неподвижной фазой, сила этого взаимодействия отличается от силы взаимодействия молекул пробы. В результате сорбция может стать более или менее прочной. С другой стороны, молекулы подвижной фазы могут конкурировать на поверхности сорбента с молекулами разделяемых соединений, вытесняя последние с активных центров и способствуя смещению равновесия в сторону десорбции.

32

Для характеристики влияния подвижной фазы на удерживание используют понятие элюирующей силы.

г) В2

Элюирующая сила подвижной фазы - это ее свойство вступать в такие межмолекулярные взаимодействия с компонентами системы, которые способствуют десорбции разделяемых соединений, более быстрому перемещению хроматографических зон.

Растворитель один подобрать трудно. Зато смесь растворителей очень увеличивает гибкость ВЭЖХ. Принцип составления таких смесей прост. Необходимо взять два индивидуальных растворителя, один из которых имеет заведомо недостаточную элюирующую силу (А1, А2), другой - заведомо избыточную (В1). Из этих двух растворителей можно приготовить множество различных подвижных фаз. Часть из них будет обязательно обладать подходящей элюирующей силой (А2,В1).

Сила растворителя является экспериментально определяемым интегральным параметром. Когда мы говорили, что растворитель имеет подходящую силу, под этим имеется ввиду, что на данном сорбенте данный сорбат будет иметь приемлемое значение К’. В то же время ясно , что для разделения уже двух соединений подойдет не любая из подвижных фаз, имеющих необходимую силу. Вещества могут иметь хорошее удерживание, но часть пиков перекрывается. В таких случаях мы говорим, что селективность системы недостаточна. Селективность (при данной НФ) определяется селективностью ПФ, что связано со специфическими взаимодействиями с сорбатами. Селективность, как и элюирующая сила бинарной подвижной фазы, определяется, в первую очередь, природой более сильного ее компонента. В составе почти любой ПФ можно найти компонент сорбционно менее активный, выполняющий преимущественно транспортную функцию (растворитель А), и сорбционно активный, который служит для регулирования равновесия (растворитель В). Роль одного и того же компонента в различных подвижных фазах и в зависимости от характера НФ, может быть различной. Например, в ПФ гексан-хлороформ последнее соединение выступает в качестве

33

растворителя В (активного), а в системе хлороформ - метанол оно же играет роль растворителя А (транспортного).

С целью повышения селективности часто используют подвижные фазы более сложного состава, чем бинарные. Во многих случаях это приводит к улучшению разделения.

12.2. Растворители.

Растворители должны быть очищены от механических примесей. Примеси вызывают плохую работу клапанов, способствуют износу плунжеров и уплотнений, забивают входные фильтры колонок. Поэтому растворители нужно фильтровать через материал с порами 0,5 мкм, при отборе растворителя из резервуара тоже нужен фильтр.

Если температура кипения растворителя низкая (ниже 600С) - ацетон, метиленхлорид, пентан, эфир и т.д., то при всасывании могут образоваться паровые пузыри, препятствующие работе клапанов. Если растворитель составной и содержит эти вещества, то состав может меняться из-за испарения этих компонентов, будет меняться TR. Но у менее летучих растворителей больше вязкость, что ведет к увеличению сопротивления колонки и к повышению давления на входе при сохранении расхода. Вязкость более 1,5сП не желательна.

В зависимости от метода детектирования, определенные требования предъявляются к растворителям. При УФ, работающем при 190-220нм, применимы вода, ацетонитрил, метанол, этанол, гексан, гептан, циклогексан и т.д. Поглощают обычно примеси, поэтому надо использовать не х/ч, а “для ЖХ” или “для спектроскопии”.

Конкретные растворители.

Вода. Лучше бидистиллят, еще лучше деионизованная и очищенная от органики. Спирты. (метанол, этанол, изопропанол) - годятся и х.ч. Для ОФХ лучше метанол - у

него меньше всего вязкость (0.54 сп), для НФ - изопропанол, неограниченно смешивающийся с углеводородами.

Ацетонитрил - удобен для ОФХ (низкая вязкость 0.34 сп)и хорошая растворимость. Ароматика - поглощает в УФ и токсична.

Алканы - гексан в НФ. Недостаточно растворяет.

Элюотропный ряд - перечень растворителей в порядке возрастания элюирующей способности.

Специфические модификаторы. Они вводятся для изменения свойств сорбента в лучшую сторону, улучшения разделения.

Уксусная кислота 0.5-2% - используется для аммоний-ацетатных буферных растворов. Поглощает ниже 230 нм.

Фосфорная кислота - в ОФХ для буферных растворов, или для создания кислой сре-

ды.

34

Аммиак - буферы в ОФХ и ИОХ.

Алкилсульфаты натрия (от С2до С12) - добавки для перевода в ион-парный режим, рН 2-5. Величина удерживания оснований растет.

Тетра и триалкиламмоний - ион-парный вариант определения кислот (с ростом концентрации ТБА растет удерживание анионов).

12.3. Выбор условий разделения.

Распределение молекул сорбатов между неподвижной и подвижной фазами определяется, в первую очередь, сравнительным сродством этих молекул к полярным или неполярным растворителям (или поверхностям). Это сродство является главным фактором, влияющим на величины удерживания, выбор неподвижной и подвижной фаз. Так, при использовании неполярных НФ (обращенно-фазная хроматография) удерживание ряда сорбатов уменьшается с увеличением их полярности, а удерживание данного сорбата на данной НФ уменьшается с уменьшением полярности ПФ, т.е. при добавлении органических растворителей. В противоположность этому, при хроматографии на полярных сорбентах (нормально-фазная хроматография) удерживание растет с ростом полярности сорбатов и уменьшением полярности ПФ. Т.е. “подобное притягивается подобным”.

Ряд правил.

1.Адсорбционная хроматографическая система обладает удерживающей способностью только в тех случаях, когда условная полярность ПФ и НФ различается в достаточной степени. Величины удерживания тем больше, чем больше разница в полярности, химической природе фаз.

2.Приемлемые величины удерживания достигаемы только в таких случаях, когда полярность сорбата является промежуточной по сравнению с полярностью ПФ и НФ. Поэтому основной способ влияния на удерживание на данном сорбенте - изменение полярности подвижной фазы.

3.При хроматографии на силикагеле удваивание концентрации полярного компонента в ПФ ведет к уменьшению удерживания В 2-2.5 раза. При хроматографии на алкилсилика-

гелях (С2, С8, С18) уменьшение концентрации растворителя в 1, 2 раза приводит к 2-2.5 кратному уменьшению удерживания сильно сорбирующихся веществ (К’>10) и 1.2-1.5 кратному уменьшению для слабо сорбирующихся (К’<2).

4.При хроматографии ионогенных соединений если рН среды такое, что допускается одновременное существование сорбата в нейтральной и ионизированных формах, степень ионизации в сорбированном и десорбированном состоянии различна. Следствие - снижение эффективности разделения, нарушение формы пика. Поэтому надо использовать ПФ на основе буферных растворов. Без этого трудно добиваться воспроизводимости и качественного разделения

В общем с понижением рН TR оснований падет, а кислот растет.

12.4. Выбор хроматографической системы.

Под термином “тип хроматографической системы” понимают сочетание: сорбента того или иного химического класса, подвижной фазы на основании водных или органических растворителей, характеризующейся интервалом рН, наличием специфических добавок кислого, основного или поверхностно-активного характера и т.д. Выбор типа системы основывается, в первую очередь, по оценке полярности и кислотно-основных свойств компонентов изучаемой системы. Условная оценка полярности анализируемых веществ, понимаемой в данном случае как относительное количество полярных и неполярных структурных фраг-