Материал: Орлов-ВЭЖХ

35

ментов, представленных в их молекулах, может быть основана на шкале упрощенного критерия гидрофобности Н. Этот критерий рассчитывается по формуле

где nH - суммарное число атомов углерода и галогенов, nf - число функциональных групп в молекуле сорбата.

Чем больше Н, тем меньше полярность, выше гидрофобность (водоотталкивание). При хроматографии неполярных сорбатов средней полярности очень часто оказыва-

ется пригодными как нормально, так и обращенно-фазные системы. Для сорбатов с низкой (ароматика) или высокой (органические кислоты, спирты) полярностью, пригодны ОФХ.

Силикагель (НФХ) селективнее при разделении изомеров (о, м, п), а также сорбатов, различающихся по функциональности (производные бензола, фенола и т.д.). При разделении гомологов (пентан - декан) спиртов, кислот лучше применять алкилсиликагели (ОФХ). Если в анализируемой смеси предполагаются компоненты разной химической природы: витамины, лекарства, наркотики, токсины, гормоны начинать разработку метода лучше с ОФХ.

Карбоновые кислоты.

В ОФХ карбоновые кислоты могут существовать как в нейтральной, так и в ионизированной формах, причем соотношение этих форм в подвижной и неподвижной фазах различно. В результате пики кислот зачастую асимметричны, а величины удерживания недостаточно стабильны. Указанные осложнения легко преодолеваются, если с помощью буферного раствора или добавки кислоты поддерживать рН подвижной фазы 2-3. Такой режим иногда называют “режимом подавления ионизации”. Однако наиболее гидрофильные (муравьиная) кислоты и в этом режиме характеризуются малыми величинами удерживания, непригодными для аналитических работ.

Для таких сорбатов можно рекомендовать ионообменную либо ион-парную хроматографию. В последнем случае в качестве неподвижных фаз используют те же алкилсиликагели, а подвижная фаза помимо буферного раствора содержит гидрофобный противоион (чаще всего тетрабулиаммоний или цетилтриметиламмоний) в концентрации 0.001-0.01 моль/л. Добавка такого ион-парного агента приводит к относительному вырастанию удерживания кислот и может помимо обеспечения необходимого удерживания, служить так же средством изменения селективности процесса.

При анализе оснований преодолеть эти проблемы труднее. Метод подавления ионизации оснований неприменим, так как силикагели неустойчивы при рН>7,5. При использовании кислых буферных растворов достигается фиксация отношений протонированной и нейтральной форм оснований. Появляется возможность хроматографировать многие вещества этой группы в ОФХ режиме. Для гидрофильных оснований (NaOH, KOH и т.д.) во многих случаях подходит хроматография на катионитах. Однако наиболее общим приемом является ион-парная хроматография на алкилсиликагелях в водно-органических растворителях, содержащих 0,001-0,01 моль/л гидрофобного противоиона (гексил или додецилсульфата). Такой режим обеспечивает приемлемое удерживание, удовлетворительную форму пиков, позволяет варьировать селективность разделения за счет изменения концентрации ион-парного реагента.

12.5. Выбор элюирующей силы и селективности подвижной фазы.

При работе в ОФХ выбор элюирующей силы сводится к выбору концентрации органического компонента подвижной фазы. В первичном случае может быть использован подход на зависимости удерживания от Н. Если известна принадлежность сорбата к определен-

36

ному классу веществ и модель удерживания этого класса в ОФХ, то задача упрощается. Для

где К’- коэффициент емкости при концентрации орг. растворителя С, Сх - концентрация орг. растворителя, необходимая для получения желаемого К’х.

В НФХ для наименее полярных фаз 15>H>10 используют гексан:ИПС (95:5) или гексан:хлороформ (1:1). Для средне полярных 10>H>5 гексан-ИПС (80:20) или хлороформметанол (95:5). Для полярных 5>H>0 хлороформ метанол (80:20).

XIII. МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЭЖХ.

13.1. Подготовка растворителей.

Фильтрование . На всасывающей линии насоса необходимо помещать фильтр с большой поверхностью, чтобы его сопротивление было минимальным, иначе при всасывании возможно образование пузырей пара, что нарушает работу клапанов. Для улучшения работы насосов можно ставить сосуды с ПФ на несколько десятков см выше насосов. Чтобы продлить срок службы фильтра, нужно предварительно фильтровать все растворители через фильтр с размерами пор 2-5 микрон.

Проверка фильтра на входе насоса. Поднять сосуд над насосом на 30-40 см. К выходу насоса подсоединить капилляр dвнутр-0.3мм,l - 50 см. Растворитель должен самотеком идти через насос - 0.5 мл/мин. Меньшая скорость говорит о засорении фильтра.

Очистка фильтра. Продуть отсоединенный фильтр сжатым воздухом изнутри. Затем на 10 мин поместить в ацетон, перемешивая ацетон, потом Н2О, потом 30% HNO3, потом Н2О. При работе в НФХ еще отмыть спиртом и 2 раза подвижной фазой.

Совместимость растворителей. Категорически запрещается использовать одновременно не полностью смешиваемые растворители (гексан-Н2О, бензол-Н2О). Допускается промывка системы растворителями, которые смешиваются между собой. Так переход с гексана на воду: гексан-чистый ИПСИПС с 50% воды80% воды. И наоборот. Особую осторожность следует проявить с буферными растворами. При их смешении с водорастворимыми органическими растворителями возможно выпадение осадков. Все узлы системы следует промывать от буферных растворов только водой. Затем можно перейти к метанолу или ацетонитрилу и далее к менее полярным орг. растворителям.

Повторное использование растворителей. Чаще всего ПФ используют однократно. Однако это не оправдано ни экономически, ни экологически. ПФ можно регенерироватьперегнать, потом снова приготовить элюент нужного состава.

Проще использовать рециркуляцию - после детектора элюент возвращается в резервуар с ПФ. При этом существенного загрязнения колонки не происходит.

а) В элюент попадают только те соединения, которые прошли колонки, т.е. сорбируются достаточно слабо. Динамического модифицирования колонки по этой же причине не происходит. Да и с точки зрения детектирования смещение базовой линии ничтожно - ведь концентрация и количество пробы очень малы. Кроме того, при рециркуляции подвижная фаза возвращается в резервуар чище, чем она там была до этого.

В случае, если подвижная фаза способна растворять сорбент, при рециркуляции этот процесс замедлен в несколько раз, и срок службы колонок будет увеличен.

Соли и буферные растворы. Ионпарные реагенты могут содержать органические соединения, поэтому их неплохо очистить пропусканием через колонку С-18. Фосфатные буферные растворы - среда для бактерий, посему их рекомендуется хранить в холодильнике. А

37

из неработающих колонок их надо вымыть. Нержавеющая сталь стоит почти во всех растворителях, за исключением формиатов, галогенидов и реактивов на металлы (ПАР и т.д.). Установка рН водно-органических растворов не проста. Поэтому указывают значения рН для водной части элюента, до смешения с орг. растворителем. Прибавление к водному буферному раствору органического растворителя может увеличить “кажущееся” значение рН на 1-2 единицы и он станет агрессивным к силикагелю.

13.2. Подготовка колонок.

Для того, чтобы избежать “перетягивания” уплотнений и выхода быстро их из строя, можно рекомендовать сборку всех коммуникаций прибора при включенном насосе. Каждое уплотнение затягивают постепенно в несколько приемов и только до устранения течи. Все это относится к уплотнениям типа “Svagelok”. Для фторопластовых уплотнений типа “Цвет” затягивать можно до упора.

Фильтры могут засоряться на входе колонки, а если сорбент крошится , то и на выходе колонки. Для замены фильтра убирают прокладку, иглой выталкивают фильтр и ставят новый.

Стабильность сорбента в колонке. Силикагель устойчив в диапазоне рН=2-7,5. Тем не менее сорбент может “садиться”, при этом нужно добавить сорбента в колонку шпателем. Увеличение сопротивления колонки может быть связано с засорением фильтров. Помогает переворот колонки. Бывает и смолообразный слой на поверхности колонки. Заменить 1-2 мм верха.

Предколонки. Можно расположить предколонку между насосом и инжектором. Она служит двум целям:

а) может сажать на себя примеси из элюента, которые могли загрязнить основную колонку (соли тяжелых металлов в ИХ),

б) если сорбент растворяется (силикагель при рН>8) то, подходя к основной колонке, он теряет свою растворяющую силу.

Предколонку можно поместить между инжектором и основной колонкой. Они защищают основную колонку от засоряющего и разрушающего действия ПФ и пробы. Они участвуют в процессе разделения, поэтому заполняются тем же сорбентом и так же тщательно.

Промывка и регенерация колонок. Для промывки используют растворители с возрастающей элюирующей силой. Объем каждого - 10 кратный объем колонки. НФ - хлороформ - этилацетат - ацетон - этанол - вода - этанол - ацетон - этилацетат - хлороформ. В ОФХ водаметанол - хлороформ - метанол - вода - 0.1М H2SO4 - вода - 0.1М NH4OH - вода. Можно проводить при t0 40-600C. Если не поможет - колонку выбросить.

13.3. Подготовка проб.

Подготовка проб преследует цели:

-перевод образца в растворитель, совместимый с используемым элюентом; -удаление компонентов и механических примесей, отрицательно влияющих на работу

хроматографа; -предварительное отделение таких компонентов, которые не представляют интереса

либо затрудняют анализ; -обогащение пробы определяемыми компонентами;

-перевод компонентов пробы в форму, способствующую селективному разделению, а также чувствительному и селективному детектированию.

Обычно навеску растворяют в растворителе, фильтруют. Растворитель - обычно подвижная фаза, что обеспечивает воспроизводимость результатов и форму пиков.

38

Нельзя использовать для растворения пробы растворители, обладающие большей элюирующей силой, чем ПФ (искажение формы пиков, осадки и т.д.).

Если рНпробы>8, надо подкислить пробу. При анализе биологических жидкостей бывают необходимы осаждение, экстракция, фильтрация и т.д.

Часто используют патроны для концентрирования пробы. Сорбент тот же, но крупный. Пропускают много пробы, далее промывают элюентом.

Иногда необходимо получить производные для обеспечения хорошего детектирова-

ния.

13.4. Разработка и описание условий анализа.

1) Использование литературных данных по решению задачи с помощью ЖХ и другими методами. Но не всегда можно слепо воспроизвести опубликованный режим (кроме ГОСТов и стандартов). Причины: неидентичность аппаратуры, сорбентов, недоступность реактивов, растворителей и т.д., недостаточная полнота описания методик.

Часто и проблема похожа, но не те: другие примеси, концентрации, пробоподготовка. Поэтому литературные данные - это отправная точка. Повышение эффективности колонки является разумным способом улучшения разделения только для достаточно сложных смесей. Для простых и умеренно сложных смесей более правильным путем улучшения разделения является оптимизация селективности, позволяющая создавать более скоростные методики разделения. Можно последовательно соединить колонки.

1) Способ элюирования (изократа или градиент). В принципе по времени ( с учетом релаксации колонки) они одинаковы, а по простоте - изократа проще.

Величины удерживания. Надо стремиться к необходимому (не избыточному) разделению за минимальное время. Оптимальное значение K’-3. При дальнейшем уменьшении концентрации сильного растворителя K’ медленно растет, а разделение очень медленно улучшается. Если при K’-3 разделение плохое, то надо изменять состав ПФ или существенно улучшать эффективность колонки. При анализе примесей К’ основного вещества должно быть 1. В начальной части хроматограммы обычно наблюдаются ложные пики различной природы. Поэтому при выборе состава элюента необходимо строго соблюдать следующее правило. Ни один интересующий пик не должен иметь К’<0,2.

Порядок таков: первоначально берут такой состав ПФ, в котором предположительные значения коэффициентов емкости будут в пределах 0,1-0,5. В этом режиме хроматографируют искусственную смесь, а затем реальный образец. Из хроматограммы искусственной смеси делают вывод, насколько надо уменьшить силу подвижной фазы, чтобы приблизиться к оптимальным значениям К’. Хроматограмма реального образца, снятая в первом режиме, позволяет выявить наличие сильносорбирующихся примесей, которые могли бы быть “потеряны” при анализе в более слабой ПФ.

Выбор несорбирующегося вещества:

ВОФХ - с УФ детектором - нитрит натрия;

срефрактометром - вода;

ВИФ - хлороформ и гексан (в УФ и RJ).

Температура колонки. На селективность температура почти не влияет, лишь на абсолютные величины удерживания. С ростом температуры происходит некоторое снижение времен удерживания, но этого можно добиться и изменением состава ПФ. В связи с этим большинство разделений в ЖХ выполняется при комнатной температуре.

Расход подвижной фазы. Обычно 1-2 мл/мин. Если колонка набита слабо, то можно увеличить расход до 3-4 мл/мин, что почти не ухудшает разделение.

Объем и концентрация пробы. Погрешность дозирования пробы падает с ростом ее объема. Но использование разбавленных проб слишком большого объема может привести к

39

значительному снижению эффективности разделения, особенно при работе с колонками эффективностью 10-20 тыс. т.т.

Чтобы реализовать всю эффективность, присущую данной колонке, объем пробы не должен превышать 1/10 часть объема, соответствующего ширине хроматографического пика на половине его высоты. Чем больше диаметр колонки, тем больше предельный объем пробы. Для колонок диаметром 4,6 мм и N=10000т.т. Vпред- 25 мкл. Количество пробы не должно превышать линейного диапазона детектора. Для ε=104 и диаметра =4,6 мм предел 10-50 мкг массы компонента. Перегрузка слоя адсорбента приводит к асимметрии пика, особенно для больших К’. Это вероятно, если С>2 мг/мл.

XIV. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1.Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 288 с.

2.Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. Рига: Зинатне, 1988. 220 с.

3.Сакодынский К.И., Бражников В.В. и др. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 464 с.