МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
(ФГБОУ ВПО «КубГУ)
Кафедра
зоологии
ВЫПУСКНАЯ КФАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА
БАКАЛАВРА
Особенности
искусственного воспроизводства медицинской пиявки (hirudo medicinalis l.) в
различных вариантах содержания маток
Работу выполнил
Л. Э. Вардо
Научный руководитель, доц.,
канд. биол. наук, доц
С. Ю. Кустов
Краснодар
2014
РЕФЕРАТ
Объём дипломной работы составляет 26 страниц компьютерного текста. Состоит из введения, основной части, состоящей из 3 глав, и заключения. Содержит 7 таблиц и 4 рисунка. Список использованной литературы включает 29 источников.
Ключевые слова: медицинская пиявка, искусственное разведение, оптимизация, МАТКА, МАССА, ПЛОТНОСТЬ ПОСАДКИ, НИТЧАТКИ.
Цель работы: изучить зависимость плодовитости маток медицинской пиявки от весовой категории и вариантов их содержания в условиях искусственного воспроизводства.
В процессе проведения работы нами оценивались параметры используемой матки медицинской пиявки (вес и плотность поселения) на их плодовитость в условиях искусственного производства. В результате исследований при разведении медицинской пиявки получены результаты, использование которых позволить оптимизировать процесс искусственного производства. Предложены оптимальные параметры величины и плотности поселения маток при закладке на спаривание и на откладку коконов.
Результаты работы доложены на международной
научно-практической конференции «Биоразнообразие. Биоконсервация.
Биомониторинг.» (Майкоп, 2013). Опубликована 1 научная статья.
ВВЕДЕНИЕ
пиявка воспроизводство разведение плодовитость
Человек на протяжении долгого времени активно использует медицинскую пиявку (Hirudo medicinalis Linnaeus, 1758). Применение пиявок в лечении ряда заболеваний известно еще с древнейших времен. Так, в Китае, Риме, Персии, Египте, Индии, Греции и других странах сохранились документальные и художественные подтверждения факта приставке пиявок человеку [Каменев, Барановский, 2005].
Интерес к Hirudo medicinalis непостоянен. Истории известны пики изучения и использования медицинских пиявок, часто ставившие вид под угрозу исчезновения. В настоящее время в ряде стран Европы эта ситуация сохраняется, в следствии чего, вид включен в Международную Красную Книгу [Кустов, Каменев, Михайлов, 2006].
Секрет слюнных желез медицинской пиявки содержит более 100 соединений белковой, липидной и углеводной природы: 20 компонентов низкомолекулярной фракции (масса менее 500 Да) и более 80 компонентов фракций с молекулярной массой свыше 500 Да [Баскова, Завалова, 2001]. Известно, что различные компоненты слюны по-разному действуют на организм человека и могут применяться в терапии многих патологических состояний.
В целях обеспечения медицинской пиявкой аптек, клиник и косметической промышленности, ее разводят на биофабриках. Процесс разведения сложен и включает ряд последовательных этапов. Самыми уязвимыми местами здесь является зачастую низкая плодовитость маток и невозможность их повторного использования по невыясненным причинам. Существующие технологии производства медицинской пиявки сильно различаются у разных производителей. Судя по публикациям и некоторым запатентованным технологическим аспектам разведения, широко используются устаревшие методы в содержании и разведении. Научно обоснованные данные по различным технологическим аспектам, таким как плотность поселения пиявок, при содержании и разведении, оптимальные параметры температуры и освещённости на разных стадиях развития, динамика кормления особей, и т.д. в научной литературе почти полностью отсутствуют [Кустов, Горбунова, Жарова, 2013]. В деле оптимизации процесса производства медицинской пиявки в искусственно созданных условиях требуется эмпирически обоснованная научная база, разработанная с учётом всех биологических особенностей жизни животного.
В соответствии со сказанным выше, целью работы стало изучение зависимости плодовитости маток медицинской пиявки от их весовой категории и вариантов содержания в условиях искусственного воспроизводства.
Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:
Изучить сроки образования поясков у маток медицинской пиявки в условиях производства;
Установить оптимальный вес маток медицинской пиявки для разведения;
Оценить оптимальное число особей матки при
ссаживании на спаривание и откладку коконов.
. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
.1 Образ жизни медицинской пиявки и обоснование
необходимости ее искусственного разведения
Пиявка - гермафродит и, таким образом, имеет как
мужские, так и женские половые железы. Размножается половым путем, но для
спаривания необходимы как минимум две особи, ибо она не способна к
самооплодотворению. Мужская половая система представлена 9-10 парами семенных
мешков, расположенных на брюшной стороне XII-XX сегментов. Размножение животных
в естественных условиях происходит в летний период. Половая зрелость у пиявок
наступает при достижении животным определенного биологического возраста, обычно
на это затрачивается до 3-х лет [Кустов, Каменев, Ярошенко, 2005]. Все зависит
от интенсивности питания, величины насасываемой однократно крови, температуры
окружающей среды и др. Однако при интенсивном выкармливании и специальном
содержании в условиях биофабрики нам удается достичь половой зрелости животного
уже на первом году его жизни. Перед спариванием пиявки проявляют характерные
признаки полового поведения. В момент совокупления каждая особь, как правило,
выступает лишь в одном качестве, однако возможно и перекрестное оплодотворение.
После оплодотворения пиявки отыскивают место для откладки коконов, которые
имеют овальную форму и снаружи покрыты губчатой оболочкой [Щеголев, 1948].
Внутри кокон содержит белковую массу, которую на определенной стадии своего
развития поглощают эмбрионы [Синева, 1949; Шумкина, 1951; 1953]. Хотя матки в
искусственных условиях откладывают до 4-5 коконов, каждый из которых может
содержать до 20 - 30 нитчаток, коконы могут вообще оказаться пустыми и не
содержать потомства. Факторы, влияющие на половое поведение животных не только
в естественных, но даже и в искусственных условиях, во многом остаются
неизученными. Новорожденные пиявки - «нитчатки» - способны питаться кровью уже
в первые дни своего рождения. Дальнейший рост определяется лишь способностью животного
«добыть» пищу. В пределах естественного ареала медицинской пиявки особенно
славились большим ее количеством водоемы Северо-Западного Кавказа, и в первую
очередь, Западного Предкавказья наиболее богаты пиявкой водоемы Краснодарского
края. В настоящее время медицинская пиявка обитает в степных реках
Краснодарского края (Бейсуг, Албаши, Ясени, Мигута и др.) и ее численность там
неуклонно сокращается [Михайлов, 2006]. Краснодарский край был одним из
важнейших регионов, в котором проводилась заготовка пиявки для аптек и
медицинских учреждений. Заготовка медицинской пиявки из естественных водоемов
проводилась с 40-х годов XX века [Кузнецова, 1961]. Однако в конце XX века
плановая заготовка пиявки на территории Краснодарского края была прекращена. С
середины 90-х годов XX века отлов медицинской пиявки из водоемов Краснодарского
края был производится браконьерами для последующей поставки в сопредельные
государства, в первую очередь в Украину. Браконьерский вылов пиявки привел к
резкому сокращению ее численности [Ярошенко, Кустов, Каменев и др., 2003;
Михайлов, Ярошенко, 2005; Кустов, Каменев, Ярошенко, 2005]. Особенно значимым
для разведения медицинской пиявки является то обстоятельство, что этот вид
занесен в Красную книгу Краснодарского края. Вид в настоящее время включен в
Красный Список Международного союза охраны природы МСОП (IUCN), и имеющим
категорию LR (таксон низкого риска угрозы исчезновения категории NT -
находящийся в состоянии, близком к угрожаемому). На территории Краснодарского
края и республики Адыгея медицинская пиявка запрещена к вылову Постановлением
главы Администрации Краснодарского края №8 от 9 января 2004 г. и Кабинета
министров республики Адыгея №2 от 19 января 2004 г.В 2006 г. медицинская пиявка
включена в список объектов флоры и фауны, вносимых в новое издание Красной
книги Краснодарского края. Список утвержден главой Администрации Краснодарского
края А.Н. Ткачевым 9 сентября 2006 г. С момента утверждения списка медицинская
пиявка считается краснокнижным видом, c присвоенной ей категорией 3 NT. В
Красную книгу Краснодарского края медицинская пиявка была внесена в 2007 г.
[Кустов, 2007], а в 2012 г. - и в Красную книгу республики Адыгея [Кустов,
Шаповалов, 2012].Таким образом, в связи с сокращением численности и ареала
медицинской пиявки в естественных условиях, а также придания ей охранного
статуса, единственно возможным способом ее получения для обеспечения нужд
медицинской и косметической промышленности остается ее искусственное
разведение.
.2 Содержание и разведение медицинской пиявки в
искусственных условиях
Медицинская пиявка является довольно простым в содержании и разведении объектом. Своеобразие питания медицинских пиявок, принимающих пищу через относительно большие промежутки времени, способность к длительному голоданию и неприхотливость к условиям содержания позволяют одновременно выращивать на небольшой площади значительное количество особей.
Технологический цикл при выращивании медицинской пиявки в условиях лаборатории сводится к следующим действиям: сортировка особей на матку, спаривание, инкубация и выборка маток, коконов и нитчаток из инкубаторов.
Процесс сортировки сводится к тому, что после кормления ведут выборку здоровых особей весом более трех грамм. Впоследствии эти особи ссаживаются в 3-литровые баллоны штук на спаривание, для чего им создаются благоприятные условия - повышенная температура, круглосуточное освещение и учащенная смена воды, стимулирующая процесс спаривания. Совокупление у медицинских пиявок может быть как односторонним, так и взаимным, которое чередуется одно с другим без какой либо закономерности [Синева, 1949]. Роль самца или самки при этом может выполнять любой из партнеров, независимо от величины. Совокупление практически всегда происходит в воде, изредка - над водой, продолжительность одного акта составляет от 15 минут до 2-х часов [Запкувене, 1972]. Стадия спаривания у пиявок длится 1-2 месяца в зависимости от температуры и условий содержания.
По мере появления маток с поясками оплодотворения производят их закладку в инкубатор. В качестве основного субстрата для закладки в инкубатор используется кусковой торф. Его тщательно моют в полиэтиленовых баках с раствором марганцовокислого калия, затем промывают чистой водой и оставляют на 2-5 дней в воде для увлажнения, после чего дают ему стечь и заполняют им 3-х литровые сосуды на 2/3 их емкости. Сосуды можно сразу применять для закладки маток на кладку коконов. В 3-х литровые сосуды с торфом маток весом 3-15 грамм помещают по 5 экземпляров. Впоследствии баллоны накрывают бязевыми салфетками, обвязывают резиновым жгутом, или накрывают обрезанной посередине крышкой, отмечают химическим карандашом дату закладки, после чего устанавливают на стеллажи. Сосуд поверх салфетки накрывают стеклянной крышкой для сохранения в нем влаги. Для закладки маток выделяют специальное помещение, которое должно быть круглосуточно затемнено. Следует исключить также возможность посторонних воздействий: шумов и запахов. Процесс кладки длится в течение 2-х месяцев. В отложенных пиявкой коконах развитие молоди продолжается в течении 28-29 дней при температуре 22-26 °С, а при температуре 18-20 °С оно затягивается до 35-45 дней (Синева, 1949). Одна матка обычно откладывает от 1 до 5 коконов, в каждом коконе содержится в среднем от 7 до 15-20 яиц. В среднем одна матка может отродить 30-40 пиявок. По выходе из кокона молодые пиявки (нитчатки) способны вести самостоятельный образ жизни. Их вес колеблется от 20 до 30 мг [Запкувене, 1972]. Однако если среда в месте нахождения кокона сухая, или окружающая температура ниже 20 °С, пиявки из коконов практически не выходят. Для стимуляции их выхода необходимо увеличить влажность и повысить температуру до 26 °С.
После закладки маток на кладку коконов проводят тщательную подготовку помещений, оборудования и инвентаря к приему молоди. Проверяют коконы на созревание, для чего их просматривают на свет. Зрелые коконы характеризуются скоплением черной массы - нитчаток у одного из своих полюсов, при нажатии они кажутся пустыми, из них не выступает белковая жидкость. Если большая часть коконов зрелая, приступают к массовому их разбору. Незрелые коконы плотные и полностью темные, оставляют в торфе на две-три недели для дозревания.
Затем выбирают из торфа коконы, просчитывают их и размещают в 3-х литровые стеклянные сосуды, в которых проводилась кладка коконов. На следующий день коконы из сосудов перемещают в чистый, заполняя его на 0,5 л водой. Молодь, вышедшую из коконов, оставляют в первом сосуде, слив из него старую воду и налив свежую. На третий день коконы перемещают в таз, последовательно один за другим разрывают и выбирают из них оставшуюся молодь.
Молодь, выбранную из коконов и торфа, размещают в 3-х литровые сосуды и просчитывают по 400 экземпляров. Отсчитав 400 пиявок, сосуд накрывают бязевой салфеткой, обвязывают резиновым жгутом, ставят на стол и берут второй сосуд, затем третий и т.д. Сосуды с пиявками, пересчитанные по 400 штук, ставят на стеллажи и последующие три дня меняют воду, затем через каждые три дня промывают до первого кормления. При содержании молодых пиявок нельзя допускать резких скачков температуры. Сразу после выхода из коконов нитчатки не нуждаются в кормлении не протяжении 10-20 дней, т.к. их пищеварительный тракт еще наполнен белком. По истечении этого срока рекомендуется начинать кормление. Челюсти нитчаток слабы и могут прокусывать только кожу земноводных. Оптимально для первого кормления использовать озерных лягушек, однако в промышленных условиях это труднодостижимо, поэтому при разведении нитчаток кормят кровью млекопитающих, предпочтительно говяжьей. Выбранную из торфа матку несколько раз промывают чистой водой и содержат на карантин неделю, ежедневно меняя воду, после чего сортируют и готовят к кормлению. В условиях лаборатории или производства возможно повторное или даже третичное использование маточного стада. Однако для получения достаточного количества жизнеспособного потомства матке необходимо пройти период реабилитации, для чего рекомендуется провести 2-3 кормления и дать ей отдохнуть после первой кладки 5-6 месяцев.
Медицинским пиявкам свойственны различные болезни [Лукин, 1976]. В основном они вызываются чрезмерным кормлением или же кормлением плохой кровью и содержанием в загрязненных сосудах. Понос и отрыгивание крови у пиявок возникают при плохом качестве пищи. В этом случае наступает смерть пиявок. При содержании в загрязненной воде наступает металлическая болезнь, характеризующаяся появлением на теле пиявок вздутий, сужений и т.п. [Стояновский, 2002]. Смерть обычно наступает на 11 день. Желтуха пиявок - болезнь, сопровождающаяся их вздутием и дряблостью тела. Инициируется при содержании в воде с высокой температурой (выше 30 °С). Однако всех этих болезней можно избежать при правильном содержании и нормальном режиме кормления здоровой и свежей кровью.
Различают три формы медицинской пиявки [Лукин, 1976]:
. Аптечная, или аптекарская медицинская пиявка (Hirudo medicinalis officinalis) имеет на спине хорошо развитые оранжево-желтые полосы, брюхо без темных пятен с двумя широкими темными полосками в виде краевой каймы. Распространена в Молдавии, Армении и в Краснодарском крае.
. Лечебная медицинская пиявка(Hirudo medicinalis medicinalis): спинные оранжевые полосы узкие с небольшими черными пятнами, брюхо усеяно темными пятнами. Распространена на территории Украины, встречается и в других местах.
. Грузинская, или персидская медицинская пиявка (Hirudo medicinalis ibericus): спина ярко-зеленая на продольных оранжевых полосах ее четырехугольные темные пятна, брюхо почти сплошь черное. Распространена в Закавказье.
Все формы медицинской пиявки легко между собой скрещиваются и дают потомство. Все перечисленные формы могут использоваться с медицинскими целями, хотя возможно, что эффективность ферментов, вырабатываемых их слюнными железами, различна. В то же время опытами доказано, что кубанская форма Hirudo medicinalis officinalis является наиболее перспективной для выращивания в искусственных условиях, т.к. обладает более высокой плодовитостью, устойчивостью к действию факторов беспокойства и высокой выносливостью. Кроме того, кубанская форма медицинской пиявки - самая «скороспелая» из перечисленных подвидов. Пиявка медицинская применяется в живом виде. Стандартной считается пиявка весом от 1 до 2 гр., в степени голодности не менее 4 месяцев. Пиявка способна к длительному (до 1,5-3 лет) голоданию. Маткой считаются крупные особи весом не менее 3-х грамм (иногда до 20 и более грамм). Однако использовать в качестве маток оптимально пиявок весом 3-7 гр.
Нитчатками считаются пиявки, только что
отродившиеся, обычно до 3-4 кормления. Молодь - пиявки весом до 1 г.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалом для работы послужили особи пиявки медицинской. Изучение различных аспектов разведения этого вида проводилось в Лаборатории проблем биологии, экологии и репродукции медицинской пиявки в станице Каневской Краснодарского края. Материалом для выполнения работы послужили особи матки пиявки медицинской различных весовых категорий в количестве 815 штук, любезно предоставленные руководителем указанной лаборатории, канд. биол. наук, доц. С.Ю. Кустовым.
Опыт проводился в период с 25.05.2013 г. по
13.10.2013 г. Матка на всех стадиях опыта содержалась в стеклянных 3-литровых
стеклянных баллонах, которые, в свою очередь, устанавливались на полузатенённые
стенды в помещении с постоянной температурой 24-25 °С.
С целью изучения возможного сопряжения параметров массы маток с количеством
отрождаемого ею потомства, была произведена сортировка пиявок по массе. В
начале опыта 25.05.2013 г. было произведено взвешивание маток и разделение всей
партии на категории по весу. Каждая пиявка из партии взвешивалась отдельно.
Взвешивание проводилось на аналитических весах с точностью до 4 знаков. После
взвешивания все особи были разделены на следующие весовые категории: 3-4 г (225
особей); 5-6 г (350 особей); 7-8 г (145 особей); более 10 г (21 особь). Внутри
каждой из выделенных четырех весовых категорий производилось повторное
разделение по способу рассадки маток на спаривание. Так, в каждой весовой
категории произвелось разделение на группы по количеству особей в каждой банке:
по 4 особи в банке; по 6 особей в банке; по 8 особей в банке; в ходе опыта все
особи находятся в одинаковых условиях освещенности и температуры. Исходные
данные приведены в таблицах 1и 2.