Материал: Подготовка посевного материала отчет

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение

высшего образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологий

Кафедра биотехнологии

Методическое пособие по получению чистого посевного материала

бактериями Cupriavidus Eutrophus для культивирования в ферментере.

Красноярск 2016

Введение

Культивирование (ферментация) - это процесс, во время которого микроорганизмы растут (увеличивают свою численность) и превращают компоненты питательной среды в целевой продукт.

Основой любого биотехнологического производства является штамм-продуцент целевого продукта. Очень важно сохранить на протя­жении длительного времени полезные свойства используемого штамма, который в дальнейшем используется для получения посевного материала, необходимого для процесса ферментации.

Организация мероприятий по сохранности музейной культуры и выращиванию чистого посевного материала является важнейшей задачей каждого биотехнологического предприятия.

Целью методических указаний является формирование у студентов практических и теоретических навыков культивирования бактерий в лабораторном ферментере. В качестве биологического агента используется штамм бактерий Cupriavidus eutrophus B10646. В учебное пособие включены все этапы приготовления посевного материала в микробиологической лаборатории и мероприятия по обеспечению сохранности музея и чистоты посева:

• подготовка стерильной лабораторной посуды;

• создание асептических условий;

• подготовка питательных сред;

• работа с музейной культурой, восполнение музея;

• микробиологический контроль;

• контроль роста и питания бактерий.

1 Подготовка стерильной лабораторной посуды

Для подготовки чистого посевного материала и музея культуры бактерий Cupriavidus eutrophus B10646 необходимо использовать следующую посуду и материалы (таблица 1).

Таблица 1 – Посуда и материалы

Перед стерилизацией лабораторную посуду помыть и высушить. Пробирки и колбы закрыть ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надеть бумажные колпачки и перевязать веревочкой.

Пробирки пробками вниз, чашки Петри, шпатели уложить в мешки для стерилизации.

В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду. Пипетки сложить в железные цилиндры (рис.1), закрыть их так, чтобы отверстия на крышке и цилиндре совпали. При упаковывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать носики. Цилиндры поместить в мешки для стерилизации.

Рисунок 1 - Железные цилиндры для хранения пипеток

Лабораторную посуду стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 минут.

2 Создание асептических условий

Асептика - условия и комплекс мероприятий, направленных на предотвращение микробного и другого загрязнения при получении стерильной продукции на всех этапах технологического процесса.

В лаборатории все работы в асептических условиях ведутся в отделении музейной культуры (боксе) в ламинарном шкафу МВ 602WSL (ламинаре). Перед работой ламинарный шкаф в течение 15 минут следует обработать ультрафиолетом, затем подождать ещё 5 минут. Перед началом работы руки и рабочие поверхности обработать спиртом, затем поджечь спиртовку. Перед каждой манипуляцией все инструменты обжечь над пламенем спиртовки (стеклянные пипетки 2-3с, бактериологические петли 20с, шпатели 10-15с, чашки Петри, горлышко колб и пробирок пред каждым открытием и закрытием 2-3с). Запрещается класть ватно-марлевые пробки на рабочую поверхность ламинара. Необходимо работать аккуратно, избегать касания инструментов с какими-либо рабочими поверхностями. Нельзя оставлять использованную посуду внутри ламинара. По окончанию работы, убрать за собой рабочую поверхность и включить ультрафиолет.

3 Подготовка питательных сред

3.1 Приготовление фосфатного буфера

Расчётное количество фосфата калия и фосфата натрия, указанное в таблице 2 растворить в дистиллированной воде при перемешивании, в конической колбе объёмом 2 л. Колбу закрыть ватно-марлевыми пробкой, обернуть пробку бумагой, перевязать веревочкой и стерилизовать в автоклаве при 121^оС, давление 1 атм., в течение 30 минут. Хранить в шкафу в боксе.

Таблица 2 – Компоненты фосфатного буфера

3.2 Приготовление раствора микроэлементов

Для приготовления раствора микроэлементов необходимо в колбу на 2 л внести поочерёдно навески солей в количествах указанных в таблице 3, довести до метки дистиллированной водой и перемешать до полного растворения, колбу закрыть ватно-марлевой пробкой, обернуть бумагой пробку и перевязать веревочкой. Стерилизовать при 121^оС, давление 1атм., в течение 30 минут. Хранить в холодильнике в боксе.

Таблица 3 – Компоненты раствора микроэлементов

3.3 Приготовление раствора MgSO₄

В конической колбе объёмом 500 мл, 3 г сульфата магния растворить в 200 мл дистиллированной воды, колбу закрыть ватно-марлевой пробкой, обернуть бумагой, перевязать веревочкой. Стерилизовать при 121^оС, давление 1атм., в течение 30 минут. Хранить в холодильнике в боксе.

3.4 Приготовление раствора NH₄Cl

10 г NH₄Cl растворить в 100 мл дистиллированной воды, в колбе объемом 500 мл, колбу закрыть ватно-марлевой пробкой, обернуть бумагой, перевязать веревочкой. Стерилизовать при 121^оС, давление 1атм., в течение 30 минут. Хранить в холодильнике в боксе.

3.5 Приготовление раствора железа (III) лимоннокислого

Необходимо на 200 мл дистиллированной воды добавить 1 г лимоннокислого железа, затем кипятить на плитке в термостойкой стеклянной посуде до полного растворения, далее раствор перелить в колбу 500 мл, закрыть ватно-марлевой пробкой, обернуть бумагой и завязать веревочкой. Стерилизовать при 121^оС, давление 1атм., в течение 30 минут. Хранить в холодильнике в боксе.

3.6 Приготовление полной среды Шлегеля (для бокса)

Среда готовится в асептических условиях в ламинаре.

Для приготовления полной среды нам понадобятся растворы: фосфатный буфер, железа (III) лимоннокислого, MgSO_4, NH₄Cl в количествах указанных в таблице 4.

Таблица 4 – Компоненты полной среды Шлегеля

Растворы в нужных количествах смешать в конической колбе объёмом 2 литра.

3.7 Приготовление пептонного агара (ПА)

10 г агара, 5 г пептона и 5 мл 2,5% раствора NaCl растворить в 0,5 л водопроводной воды, в колбе объемом 1л, закрыть ватно-марлевой пробкой, обернуть бумагой, перевязать веревочкой.

Стерилизовать при давлении в 1атм., в течение 30 минут. Хранить в шкафу в боксе.

3.8 Приготовление стерильной водопроводной воды

В колбу на 1 л налить 500 мл водопроводной воды, закрыть ватно-марлевой пробкой, обернуть бумагой, перевязать веревочкой.

Стерилизовать при давлении в 1атм., в течение 30 минут. Хранить в шкафу в боксе.

4 Приготовление инокулята

4.1 Получение посевного материала

Все работы ведутся в асептических условиях в ламинарном шкафу.

Музейную культуру, хранящуюся на скошенной агаризованной среде в холодильнике, смыть с поверхности среды (4 пробирки) в стерильную коническую колбу ёмкостью 2 л с 1 л полной средой Шлегеля. В пробирку с культурой добавить небольшое количество среды, с помощью бактериологической петли, смыть культуру с поверхности агара, петлю перед началом работы прокалить над пламенем спиртовки. Полученный раствор слить в колбу. Промыть пробирку ещё несколько раз, чтобы там не оставалось культуры, остатки также слить в колбу. Далее стеклянной пипеткой добавить 20 мл/л глюкозы или фруктозы, в зависимости от используемого субстрата. После этого необходимо отобрать пробу и произвести микробиологический контроль культуры (п. 5). Колбы закрыть стерильными ватно-марлевыми пробками и бумагой, разместить в гнезда шейкера инкубатора Innova 44 (рис.2), проверить температуру (30^оС) и обороты (250 оборотов), нажать кнопку «START».

Рисунок 2 - Шейкер инкубатора Innova 44

сверху - в закрытом виде; снизу – с открытой дверцей.

Необходимо периодически осуществлять биохимический контроль посевного материала (п. 7) с целью определения оптической плотности и количество оставшегося субстрата в культуре, при необходимости восполнить требуемые концентрации питательных растворов.