4.2 Разведение микробной культуры

Все работы ведутся в асептических условиях в ламинарном шкафу.

Для обеспечения роста микробного штамма, необходимо производить разбавление культуры при достижении оптической плотности около 4 г/л.

Для этого необходимо разлить культуру с помощью стерильного мерного цилиндра 500 мл в стерильные колбы на 2 л и разбавить полной средой Шлегеля 500 мл так, чтобы после разведения оптическая плотность в полученном инокуляте была не ниже 1 г/л.. Колбы, закрытые ватно-марлевыми пробками, размещают в шейкере инкубаторе Innova 44, и цикл выращивания продолжают до достижения культурой 5 г/л. По достижению необходимой плотности, перед посевом инокулята в ферментер, производят микробиологический контроль (п. 5).

5 Микробиологический контроль

Все работы ведутся в асептических условиях в ламинарном шкафу.

При подготовке посевного материала (инокулята) микробиологический контроль производят 2 раза. Первый – после смыва музейной культуры в колбы, второй – перед посевом бактерий в ферментер.

Рисунок 3 - Осуществление микробиологического контроля

в ламинарном шкафу МВ 602WSL.

Для проверки стерильности посевного материала и питательных сред необходимо производить высев на агаризованную среду.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производить стерильно над пламенем горелки.

Перед посевом всю посуду проверить на целостность. Для посева бактерий применять пептонный агар.

Работа по микробиологическому контролю включает четыре этапа:

- подготовка плотной питательной среды для посева;

- приготовление разведений;

- посев на плотную питательную среду в чашки Петри;

- визуальная оценка выросших колоний.

Присутствие хотя бы одной посто­ронней колонии в высеве с данной партии посевного материала выбрако­вывает всю партию. 

5.1 Подготовка плотной питательной среды для посева.

В приоткрытые стерильные чашки Петри (3-4 шт) налить из колбы расплавленную в микроволновой печи стерильную и охлажденную агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки закрыть и оставить в ламинаре пока не застынет агар, в это время приготовить разведения культуры микроорганизмов.

5.2 Приготовление разведений.

Количество микроорганизмов в посевном материале велико и для получения отдельных колоний производят ряд разведений.

Разведения готовят в стерильной водопроводной воде. Для работы необходимо 7 стерильных пробирок, закрытых ватно-марлевыми пробками. Стеклянной пипеткой в каждую пробирку из колбы вносить по 4,5 мл водопроводной воды. Далее из колбы с посевным материалом стеклянной пипеткой с помощью груши отобрать 1 мл культуры в первую пробирку, содержимое тщательно перемешать, и уже из первой пробирки 0,5 мл разбавленной культуры переносить в последующую, так разведения повторяют 6 раз. На рис. 4 представлено проведение разведений и посева.

Для приготовления каждого разведения обязательно использовать отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.

Рисунок 4 –Проведение разведений и посева

5.3 Посев на плотную питательную среду в чашки Петри

После того как среда застынет, посев делать из пробирки с последним разведением. Стерильной пипеткой нанести каплю соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешать содержимое пробирки, на поверхность агаровой пластинки в каждую чашку Петри. Этот объем распределить по поверхности агара стерильным шпателем.

На чашках Петри со стороны дна подписать название засеянного материала, дату посева и свои инициалы.

5.4 Визуальная оценка выросших колоний

После посева чашки Петри поместить в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдержать в термостате в течение 1 —7 суток в зависимости от скорости роста микроорга­низмов. Посевы ежедневно проверять.

Бактерии штамма Cupriavidus eutrophus B10646 выглядят как изолированные морфологически однородные округлые колонии светло-кремовые, непрозрачные со слегка волнистым краем диаметром 2-4 мм (рис.5).

Рисунок 5 – Колония бактерий штамма Cupriavidus eutrophus B10646 в чашке Петри

При наличии роста посторонних микробов хотя бы в одной чашке, проводить дополнительное повторное исследование. В случае повторного прорастания в средах тех же микробов, что и в первый раз, посевной считается нестерильным.

Стерильными считать пробы посевного материала, в посевах которых отсутствуют посевы посторонних микроорганизмам ни на одной чашке Петри через восемь суток с начала посева или через 5 суток с момента пересева.

6 Восполнение музейной культуры

Работа проводится в асептических условиях в ламинарном шкафу.

Для восполнения музея для начала необходимо 3 стерильные большие пробирки наполнить заранее расплавленным теплым агаром на 1/3 часть, положить под углом на стеклянную трубочку до застывания (рис.6).

Рисунок 6 – Пробирки с агаром

По истечении времени застывания сделать отсев на поверхность скошенной плотной среды. Профламбированной микробиологической петлей отобрать одну изолированную колонию, находящуюся на чашке Петри в термостате, далее штриховыми движениями распределить микроорганизмы в пробирке по всей поверхности скошенного агара. Маркированные косяки поместить в термостат, после прорастания, убрать в холодильник. Таким образом, производится пересев музейной культуры.

Для проверки музейной культуры на чистоту, необходимо визуально осмотреть выросшие микроорганизмы, колонии должны быть однородные светло-кремового цвета. Или же небольшое количество микроорганизмов поддеть микробиологической петлей и растворить в пробирке с 2-3 мл стерильной водопроводной воды. Произвести истощающий посев на 5 чашек Петри. Бактериальную петлю окунуть в пробирку с разведением, положить плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности. Шпателем провести штрихи по всей среде. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые шпателем, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микроорганизмов.

7 Биохимический контроль

Отбор культуры для анализа проб производится в асептических условиях в ламинарном шкафу МВ 602WSL. Из колбы с культурой в пробирку налить 5 мл инокулята, колбу закрыть и снова поставить на качалку.

7.1 Измерение оптической плотности

Изменение биомассы клеток в процессе развития культуры регистрируется оптическими показателями культуры.

Для измерения оптической плотности необходимо периодически отбирать пробы культуры: 1 мл пробы развести 5 мл дистиллированной воды и перемешать. Разведенную пробу залить в кюветы на 1 мм и измерять в фотометре «КФК-2МП» (рис.7). В качестве контроля использовать дистиллированную воду. Измерение проводить при длине волны в 440 нм.

Рисунок 7 - Фотометр «КФК-2МП».

7.2 Измерение количества азота

Необходимо отобрать 2 мл инокулята, открутить на центрифуге «Hanil Micro-6» (рис. 9) до полного осаждения пробы, после чего 1 мл надосадочной жидкости залить 10 мл дистиллированной воды. Добавить 1-2 капли 33% KOH и 0,5 мл реактива Нестлера. Результат наблюдать по цветовой реакции (рис. 8).

0 1 2 3

Рисунок 8 - Качественная реакция на аммиачный азот

0 – добавить 10 мл NH₄Cl; 1 – добавить 6 мл NH₄Cl; 2, 3 – достаточное количество азота

Рисунок 9 - Центрифуга «Hanil Micro-6»

7.3 Определения концентрации фруктозы в инокуляте

Необходимо отобрать 2 мл инокулята, открутить на центрифуге «Hanil Micro-6» до полного осаждения пробы, после чего 0,5 мл надосадочной жидкости разбавить в 50 мл дистиллированной воды. Далее 1 мл разбавленной культуры внести в пробирку, добавить 1 мл спирта резорцина и 3 мл разбавленной соляной кислоты с концентрацией 5:1 по отношению к воде. В качестве контроля использовать воду. Приготовленные пробирки поместить на водяную баню при 80^оС на 20 минут. По истечении времени пробы остудить, измерить оптическую плотность на фотоколориметре КФК-2МП, и λ=540 нм (длина оптического пути 10 мм), концентрацию фруктозы определять по калибровочному графику.

Оптимальная концентрация при восполнении субстрата фруктозы - 20 г/л.

7.4 Определение концентрации глюкозы в инокуляте

Для определения концентрации глюкозы в инокуляте необходимо открутить 2 мл культуральной жидкости на центрифуге «Hanil Micro-6» до полного осаждения пробы, после 1 мл культуральной жидкости разбавить дистиллированной водой в соотношении 1:4. В 3 пробирки в отдельности внести по 40 мкл: дистиллированная вода (контроль), калибратор из набора «Глюкоза - ФКД», разбавленная надосадочная жидкость. После во все три пробирки добавить по 2 мл ферментно-хромогенной смеси (2 мл). Оставить на 25 минут (после 5-10 минут после добавления ФХС взболтать пробирки). Оптическую плотность измерить на фотометре «КФК-3», кюветы на 5 мм, с длинной волны 490 нм. Результат рассчитать по формуле (1):

Кол-во глюкозы (г/л) = (О.П.опыт/О.П.калибратор)*9 (1)

Оптимальная концентрация при восполнении субстрата глюкозы - 20 г/л.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изложенная в данном учебном пособии технология является основой для получения посевного материала и позволяет реализовать процесс биосинтеза, как в лабораторных, так и в промышленных ферментерах. Только строгое выполнение всего комплекса мероприятий и своевременного контроля позволит сохранить и приумножить качественную музейную культуру, обеспечит биотехнологический процесс чистым посевным материалом, и конечно, является основой и залогом экономической стабильности любого биотехнологического предприятия.

Данные методические указания разработаны для проведения лабораторных практикумов и работ по направлению «Культивирование микроорганизмов в лабораторных ферментерах».