Введение
Актуальность проблемы. Трудно назвать другую группу среди низших беспозвоночных, столь же парадоксальную с точки зрения морфологии и физиологии, какой являются бескишечные турбеллярии (Acoela), мелкие морские червеобразные животные, населяющие различные прибрежные биотопы. Для этого отряда характерна уникальная организация пищеварительного аппарата, и почти столь же необычно строение их нервной системы и половых органов. По существу, бескишечные турбеллярии устроены проще, чем любые другие свободноживущие билатерии, причем простота их организации, скорее всего, отражает филогенетическую примитивность - молекулярные данные показывают, что Acoela являются сестринской группой для всех ныне живущих трехслойных животных (см. обзор в Baguса & Ruitort 2004).
Простота организации бескишечных турбеллярий служит серьезным препятствием при установлении филогенетических связей в пределах группы, существенно ограничивая число признаков, которые могут быть использованы при построении таксономической системы. В этой ситуации органы половой системы, достигающие у Acoela сложности, необычной на фоне примитивности других систем, становятся незаменимыми (а иногда и единственными) источниками филогенетической информации. В то время как признаки мужских копулятивных органов широко используются в принятой сегодня системе (Dцrjes, 1968), органы женского полового аппарата (бурсы и их наконечники) изучены мало и, по существу, остаются за пределами внимания исследователей. Наконечники бурс представляют собой сложные многоклеточные образования и, очевидно, что стандартные гистологические методики недостаточны для их всестороннего изучения. В этой ситуации неоценимую помощь могут оказать методы электронной микроскопии. К сожалению, в настоящее время существует лишь одна работа (Brьggemann 1985), в которой наконечники бурс рассматриваются на ультраструктурном уровне.
Особенности ультраструктуры спермиев активно используются систематиками при исследовании самых разных групп беспозвоночных. Недавно было показано их потенциальное значение и в систематике бескишечных турбеллярий (Raikova et al. 2001; Hooge et al. 2002). К сожалению, на текущий момент ультраструктура спермиев известна только для 32 видов Acoela и лишь примерно половина спермиев из этого списка исследована достаточно детально для того, чтобы на основе этой информации можно было делать таксономические или филогенетические выводы.
В целом, построение таксономической системы Acoela еще далеко от завершения, и комплексное исследование спермиев и женских половых органов, предпринятое в данной работе, может привести к существенному прогрессу в этом вопросе.
Цели и задачи исследования. Цель исследования - дать сравнительную и функциональную характеристику спермиев и наконечников бурс бескишечных турбеллярий и выявить таксономически значимые признаки.
В задачи работы входило:
· выбрать представителей с неясным или спорным таксономическим положением;
· провести ультраструктурное исследование спермиев;
· выяснить функциональную роль элементов цитоскелета в локомоции спермиев;
· провести комплексное (ультраструктурное и гистохимическое) исследование бурс и их склеротизированных придатков;
· выяснить функциональную роль склеротизированных придатков бурс и вероятные пути их эволюции;
· провести таксономическую оценку рассмотренных семейств Acoela.
Научная новизна работы. Проведен анализ ультраструктурной организации спермиев у 11 представителей бескишечных турбеллярий. Кроме четырех типов ацельных спермиев, уже описанных другими авторами, выявлены два новых типа с промежуточными характеристиками микротрубочкого цитоскелета. Впервые описаны цитоплазматические микротрубочки у спермиев сем. Mecynostomidae. Обосновано положение о функциональной взаимосвязи между двигательным аппаратом спермия (аксонемами) и его цитоскелетом. Рассмотрены особенности эволюции спермиев в пределах отряда, представлена эволюционная схема, обобщающая молекулярные и ультраструктурные данные.
Проведено первое детальное сравнительно-анатомическое исследование бурс и их склеротизированных придатков. Впервые применен комплексный подход к изучению строения наконечников с использованием электронной микроскопии и гистохимических методов (окраска фаллоидином). Органы женской половой системы были исследованы у 7 представителей Acoela. Выявлена высокая морфологическая изменчивость наконечников бурс. Одновременно в работе были обнаружены также и общие признаки, характеризующие все исследованные склеротизированные придатки. В частности, показано, что наконечники, также как и стенка бурсы, во всех случаях состоят из специализированных уплощенных клеток, расположенных концентрическими слоями. В целом выделено четыре основных типа склеротизированных придатков. Установлено, что так называемые клеточные колпачки представляют собой специализированную форму наконечников. Приводятся новые данные о функциональной роли наконечников и об их участии в оплодотворении. В качестве обобщения представлена картина формирования вооружения и опорных структур в разных группах низших билатерий: показано, что во многих случаях эти структуры являются дериватами элементов цитоскелета, в состав которых входят актиновые микрофиламенты.
Теоретическое и практическое значение. Данные по ультраструктуре спермиев могут послужить хорошей теоретической основой для установления таксономических групп ранга семейства и надсемейства, как было показано на примере конволютид и изодиаметрид. Эти результаты также важны для понимания закономерностей эволюции спермиев как в пределах Acoela, так и в других группах беспозвоночных. Техника фаллоидиновой окраски может в дальнейшем быть использована для уточнения морфологических данных по наконечникам бурс, так как она предоставляет исключительно точную информацию по распределению актиновых микрофиламентов в клетках и не требует сложного оборудования и больших затрат времени. Новые данные по морфологии спермиев и наконечников бурс могут найти свое отражение в учебниках и монографиях по бескишечным турбелляриям.
1. Сравнительная характеристика половой системы бескишечных турбеллярий
Общий обзор половой системы. В разделе приводится краткая характеристика половой системы Acoela - особое внимание уделяется мужским и женским копулятивным органам.
Ультраструктура спермиев. На светооптическом уровне спермии, принадлежащие разным группам Acoela, лишь незначительно отличаются друг от друга. Сперматозоиды бескишечных турбеллярий имеют нитевидную или лентовидную форму и неизменно несут две аксонемы, инкорпорированные в цитоплазму клетки. В спермиях бескишечных турбеллярий обычно можно различить три отдела. В проксимальном участке сперматозоида расположено удлиненное ядро. Далее следует промежуточный, или средний, отдел, включающий все крупные клеточные органеллы (митохондрии и цитоплазматические гранулы). Последний, дистальный, участок спермия образует узкий хвостовой отдел - в этот отдел заходят лишь аксонемы, прочие цитоплазматические органеллы в нем отсутствуют. В спермиях обнаруживаются два типа включений, отграниченных от цитоплазмы мембраной. Более крупные преломляющие гранулы хорошо видны при изучении мазков спермиев методами фазово-контрастной микроскопии, благодаря своим светопреломляющим свойствам. Так называемые плотные включения обычно мельче преломляющих гранул и на светомикроскопическом уровне, как правило, не просматриваются.
Ультраструктурные исследования выявили существенные вариации во внутренней организации спермиев. Это разнообразие в значительной степени определяется составом и расположением микротрубочек, как тех, что формируют аксонемы, так и тех, что лежат непосредственно в цитоплазме спермия. У большинства представителей Acoela аксонемы спермиев имеют конфигурацию (далее обозначаемую как 9+2), обычную для ресничек и жгутиков: девять дуплетов по периферии аксонемы и пара синглетов в центре (рис. 1а, б). Описаны еще два варианта организации аксонем (9+1 и 9+0): в первом случае редуцируется одна из центральных микротрубочек (рис. 1в), во втором - исчезают оба центральных синглета (рис. 1г).
бескишечный турбеллярия филогенетический цитоскелет
Рис. 1. Типы спермиев бескишечных турбеллярий. а - аксонемы 9+2 и кортикальные микротрубочки; б - аксонемы 9+2 и аксиальные микротрубочки; в - аксонемы 9+1, конфигурация цитоплазматических микротрубочек неизвестна; г - аксонемы 9+0 и аксиальные микротрубочки.
У большинства исследованных спермиев с аксонемами 9+2 цитоплазматические микротрубочки располагаются в кортикальной области клетки и ориентированы более или менее параллельно продольной оси спермия (рис. 1а). У некоторых спермиев с аксонемами 9+2 и у всех спермиев с аксонемами 9+0 цитоплазматические микротрубочки расположены одной или несколькими группами ближе к центру клетки (аксиальные микротрубочки - рис. 2б, г). Спермии с аксонемами формулы 9+1 тоже, как правило, относят к этой группе (см., например, Raikova 2001), однако на самом деле цитоплазматические микротрубочки у этих спермиев неизвестны (рис. 2в).
Семенные сумки и их придатки. Женские копулятивные органы бескишечных турбеллярий имеют весьма разнообразное строение. Как правило, присутствует одна или несколько семенных сумок (бурс), чаще всего открывающихся на поверхность эпителизованным каналом (вагиной, или влагалищем) - бурсы служат резервуарами для хранения спермы партнера, прежде чем та поступит к оплодотворяемому яйцу.
У многих видов семенные сумки образуют придатки в форме жестких склеротизированных трубок (мундштуков, или наконечников, бурс). Принято считать, что наконечник представляет собой специализированный семенной канал (ductus spermaticus), служащий для подведения спермиев к оплодотворяемым яйцеклеткам.
Детали ультраструктуры наконечника известны лишь для одного вида бескишечных турбеллярий - Philocelis cellata (Brьggemann 1985, 1986). Наконечник образован склеротизированной трубкой, отходящей от стенки бурсы в направлении ооцитов, конусовидно сужаясь к своему дистальному концу. Основу трубки составляют дисковидные склеротизированные клетки, расположенные в ряд наподобие стопки тарелок. В центре каждая клетка пронизана отверстием, причем отверстия расположены друг над другом, образуя единый канал. Клеточные тела, содержащие уплощенные ядра, занимают периферию дисков, формируя расширенный внешний край. Внутренний край клеток, прилегающий к просвету канала, также образует шайбовидное расширение, причем цитоплазма этой центральной части заполнена плотным фибриллярным материалом, укрепляющим канал наконечника. Таким образом, каждая склеротизированная клетка имеет вздутые края по внешней и внутренней окружностям, между которыми цитоплазма сужена в тонкую пластинку. Промежуточные клетки расположены в пространствах, образованных тонкими участками дисков; эти клетки не содержат фибриллярного вещества и никогда не достигают просвета канала.
Для некоторых видов бескишечных турбеллярий было недавно показано, что фибриллярный материал, участвующий в склеротизации наконечников, представлен актиновыми филаментами (Hooge & Tyler 2001).
Функциональная роль наконечников. Согласно мнению, которое разделяет сегодня большинство исследователей, наконечники используются в качестве каналов, по которым хранящаяся в семенных сумках сперма партнера поступает в область яичников, где осуществляется оплодотворение. Тем не менее, высказывались и другие гипотезы - предполагалось, что наконечники могут резорбировать избыточную сперму (Graff 1874; Costello & Costello 1968), прокалывать покровы партнера перед осеменением (Gardiner 1898), осуществлять сортировку, дозировку (Henley 1974; Богута 1971; Brьggemann 1985) или модификацию спермы (Богута 1971), принимать участие в наружно-внутреннем оплодотворении (Мамкаев, 1967).
Замечания по терминологии. В разделе приводится список ключевых терминов, используемых в диссертации.
2. Материал и методика
Использованные в работе животные (табл. 1) экстрагировались из грунта или с водорослей с помощью водных растворов хлористого или сернокислого магния изотонических морской воде (Sterrer 1971). Для исследования ультраструктуры материал фиксировался в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере при температуре 4єС. Далее животных постфиксировали в 1%-ном растворе OsO4 на фосфатном буфере с последующим проводкой через серию водных растворов ацетона повышающейся концентрации. В качестве заливочных смол использовалась смесь Аралдита с Эпоном (EMBed/Araldite). Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультратоме Sorval 2MT-B с использованием стеклянных и алмазных ножей. Полутонкие срезы (3-5 мкм толщиной) окрашивались раствором толуидинового синего. Контрастирование ультратонких срезов проводилось на сетках в водном растворе уранилацетата и цитрата свинца. Фиксация и проводка были ускорены посредством микроволнового излучения (на микроволновой печке Samsung - 7-секундное излучение при 650 Вт, разделенное 20-секундным интервалом: Giberson & Demaree 1995). Материал изучался на электронном микроскопе Philips CM10. Электронные микрофотографии были получены с помощью цифровой камеры (CCD Camera, BioScan, Gatan).
Животных, приготовленных для исследования посредством конфокальной лазерной микроскопии, фиксировали в растворе 4%-ного формалина и окрашивали снабженным флуоресцентной меткой фаллоидином (Alexa 488; Molecular probes, Eugene, OR) по Hooge (2001).
Для изготовления мазков спермиев и последующего их изучения методами контрастной микроскопии, животные придавливались покровным стеклом с постепенным увеличением давления, пока спермии не выходили наружу через разрыв в стенке тела.