Рис. 3. Морфологический ряд, показывающий возможный путь эволюционных изменений спермиев от состояния с кортикальными микротрубочками (слева) до состояния, характерного для спермиев с аксонемами 9+0 (справа)
Цитоскелет спермиев: морфофункциональные аспекты. В соответствии с общепринятой сегодня скользящей моделью, конформационные изменения динеиновых ручек, связанных с периферическими микротрубочками, вызывают изгиб аксонемы, при этом центральная пара микротрубочек вместе с окружающим ее цилиндром благодаря своей упругости обеспечивает возвратное движение, приводящее к выпрямлению ундулиподии. Приведенная схема верна для движения свободных жгутиков, но у спермиев бескишечных турбеллярий аксонемы инкорпорированы в цитоплазму и, следовательно, существующая модель нуждается в некоторых уточнениях. У Acoela все цитоплазматическое тело спермия изгибается как единое целое - в этой ситуации роль упругого стержня, опосредующего выпрямление спермия при возвратном движении аксонем, принимают на себя цитоплазматические (в основном, аксиальные) микротрубочки. В связи с этим интересно отметить, что отсутствие центральных микротрубочек в аксонемах почти всегда коррелирует с наличием аксиальных микротрубочек в цитоплазме. Это правило распространяется и на аберрантные спермии Notocelis gullmarensis - в дистальной части спермия мы встречаем кортикальные микротрубочки и аксонемы 9+2, а в проксимальной части, где расположен аксиальный стержень, аксонемы приобретают структуру 9+0. Вероятно, когда аксиальные микротрубочки принимают на себя функцию разгибателей, центральные микротрубочки в аксонемах, ранее выполнявшие аналогичные задачи, становятся ненужными, и, как следствие, полностью пропадают в этой эволюционной линии.
Таким образом, как и следовало ожидать, эволюционные изменения спермиев и их цитоскелета определяются, прежде всего, локомоторными задачами - необходимостью находить путь к яйцеклетке, двигаясь в вязкой среде, каковой являются межклетники паренхимы. Эта необходимость привела к возникновению инкорпорированных в цитоплазму аксонем, что, в свою очередь, определило дальнейшее направление эволюции по совершенствованию и дифференцировке элементов цитоскелета. При движении к более продвинутым формам происходит постепенная консолидация цитоплазматических микротрубочек с образованием осевого цилиндра в центре клетки, что, в конечном счете, приводит к появлению спермиев с более совершенными морфодинамическими характеристиками.
4. Ультраструктура и гистохимия бурс и их наконечников
Результаты. Раздел посвящен описанию бурс и их склеротизированных придатков у 7 представителей бескишечных турбеллярий.
Notocelis gullmarensis. Небольшая бурса овальной формы с каудальной стороны открывается на поверхность широкой безресничной вагиной. Короткий бочонковидный наконечник направлен вперед, к яичнику. Стенка бурсы составлена из серии тонких, плотно упакованных, концентрических слоев. Уплощенные ядра располагаются в стенке бурсы без какой-либо упорядоченности. Наконечник состоит из 10-12 расширенных на концах отростков, принадлежащих клеткам стенки; отростки несколько отогнуты внутрь, в полость бурсы. Преддверие и промежуточные клетки отсутствуют. Актиновые микрофиламенты сосредоточены в основном в концевых участках отростков, окружающих канал наконечника.
Daku woorimensis. Вытянутая в дорсо-вентральном направлении бурса занимает положение непосредственно перед мужским совокупительным аппаратом. С фронтальной стороны стенка бурсы утолщена, образуя клеточный колпачок, обычно упирающийся и даже вдавленный в яйцо. Колпачок содержит тела клеток уплощенной формы, чьи периферические отростки образуют собственно стенку бурсы, так что последняя составлена из серии тонких концентрических клеточных слоев (n > 20) и лишена ядер. БольDefault (Version 1): Global-Right-Button05b.pngшинство ядер лежит ближе к периферии клеточного колпачка, а их центральные отростки формируют серию склеротизированных сегментов (n>10). Колпачок состоит из клеток двух типов. Эти клетки отчетливо различаются по электронной плотности, и так как они расположены чередующимися рядами, создается впечатление, что электронноплотные слои перемежаются в колпачке с электронносветлыми. Клетки с более электронноплотной цитоплазмой принимают участие в формировании склеротизированных сегментов, а электронносветлые клетки заполняют пространство между сегментами. Сегменты расположены в виде цепочки и уменьшаются в размере к периферии колпачка. В покоящемся состоянии, когда колпачок лишен спермы, канал каждого склеротизированного сегмента закрыт, наподобие пробки, так называемой осевой клеткой. В колпачке, через который проходит сперма, осевые клетки в канале либо отсутствуют, либо демонстрируют признаки дегенерации. У некоторых экземпляров колпачок содержит крупные лакуны, расположенные между соседними сегментами и заполненные плотно упакованными спермиям.
Aphanostoma bruscai. Вытянутая в дорсо-вентральном направлении бурса открывается в общий антрум короткой ресничной вагиной. В месте соединения с вагиной стенка бурсы образует пузыревидное расширение, обособленное от остальной бурсы узкой трубковидной перетяжкой. Вентрально стенка бурсы утолщается, формируя клеточный колпачок. На ультраструктурном уровне клеточный колпачок представляет собой стопку уплощенных клеток, расположенных в виде розетки вокруг общего центра. Стенка бурсы образована уплощенными периферическими отростками, отходящими от клеток колпачка и окружающими бурсу 25-30 плотно упакованными слоями. Все ядросодержащие части клеток расположены внутри клеточного колпачка и в прилегающем к вагине пузыревидном придатке - стенки же бурсы полностью лишены ядер. Склеротизированные сегменты образованы центральными отростками клеток колпачка, усиленными сетью актиновых микрофиламентов. Микрофиламенты заполняют все пространство клеточного отростка в той его части, которая прилегает к просвету канала. Напротив, на периферии склеротизированных сегментов актин наблюдается лишь в тонком слое непосредственно вдоль клеточных мембран, а вся центральная часть цитоплазмы заполнена многочисленными секреторными гранулами. Цепочка склеротизированных сегментов (n=8-12) тянется более или менее вдоль центральной (дорсо-вентральной) оси клеточного колпачка. Неясно, связаны ли отдельные сегменты между собой единым каналом или, по крайней мере, системой лакун, найденных у D. woorimensis, но позади сегментов, прилегающих к полости бурсы, иногда обнаруживаются небольшие межклеточные пространства. Только те склеротизированные сегменты, которые прилегают к полости бурсы, содержат спермии, просветы сегментов, расположенных в толще клеточного колпачка, закрыты осевыми клетками.
Aphanostoma virescens. Наконечник и бурса A. virescens исследовались гистологическими и гистохимическими методами. Ультраструктурное исследование не проводилось. Вагина и мужской совокупительный орган открываются в общий антрум так, что мужское отверстие лежит слева от женского. Вагина несет реснички и заканчивается мощным мускульным сфинктером на границе с бурсой. Вентрально стенка бурсы образует утолщение (клеточный колпачок), составленное из расположенных слоями уплощенных клеток. На остальном своем протяжении стенка бурсы не содержит ядер и состоит из плотно упакованных цитоплазматических ламелл. Конфокальные микрофотографии показывают, что колпачок содержит 5-7 склеротизированных колец (сегментов составного наконечника), усиленных актиновыми филаментами.
Wulguru cuspidata. Крупная двулопастная бурса несет два длинных боковых наконечника, ориентированных косо назад, в направлении противоположном яичнику. Стенка бурсы составлена несколькими рядами уплощенных клеток, образующих тонкие пластинчатые отростки. Эти отростки вытягиваются на значительное расстояние, охватывая полость бурсы концентрическими слоями. Наконечник представляет собой слоистую пирамидальную структуру, состоящую из 60-70 рядов склеротизированных клеток, чьи клеточные тела расположены на периферии придатка, а центральные отростки формируют скелетную основу семенного канала. Склеротизированная часть канала образуется за счет аккумуляции актина в отростках склеротизированных клеток, направленных к центральной оси наконечника. Эти отростки образуют вздутие, неизменно ориентированное своим утолщенным краем к дистальному концу наконечника. В радиальном направлении содержание актина в клетках постепенно уменьшается. Между центральным утолщением и ядросодержащей частью цитоплазма отростка образует тонкую пластинку. В пространствах между пластинками расположены бедные актином промежуточные клетки. Пара длинных, тонких клеточных отростков проходит внутри семенного канала по всей его длине, третий отросток доходит только до половины длины канала. Не исключено, что эти отростки представляют собой истонченные проксимальные участки спермиев, проникающие в просвет семенного канала. Снаружи наконечник целиком окружен несколькими рядами кроющих клеток. Структура, образованная этими клетками, является непосредственным продолжением стенки бурсы, и, наконечник, таким образом, целиком погружен в полость семенной сумки. У выхода из наконечника кроющие клетки оставляют довольно широкое овальное отверстие. По краям этого отверстия отростки кроющих клеток заворачиваются вовнутрь и идут в обратном направлении - в образованной ими петле располагаются кольцевые мышечные волокна (мускульный сфинктер).
Pseudmecynostomum phoca. Стенка бурсы состоит из двух или трех слоев уплощенных клеток. Структура, напоминающая склеротизированный наконечник (вагинальный наконечник), отходит от вентральной стороны бурсы. Клеточные тела склеротизированных клеток расположены наподобие долек апельсина вокруг центрального канала (вагины?), открывающегося на поверхность слабо выраженным половым отверстием. Дорсально каждая клетка продолжается в виде тонкого цитоплазматического отростка (всего удалось насчитать 24-26 таких отростков) - эти отростки следуют вертикально вверх, сходясь вместе в виде параллельного пучка с трубковидным просветом в центре. Образованный таким способом проток содержит густую сеть актиновых филаментов и представляет собой склеротизированный канал наконечника. Отростки склеротизированных клеток расположены в стенке канала 12-13 концентрическими слоями. Ближе к просвету бурсы отростки поворачивают под острым или прямым углом наружу и продолжаются в радиальном направлении в виде широких пластинок, содержащих уже довольно рассеянную сеть микрофиламентов. Поверхность отростков на радиальном участке образует извилистые выпячивания, которые вклиниваются в противолежащие впадины соседних отростков - возникает своего рода «губчатая» масса, составленная из зигзагообразно сцепленных друг с другом цитоплазматических слоев. Отростки склеротизированных клеток оканчиваются на периферии наконечника в виде образующих петли и изгибы пластинок, теперь уже полностью лишенных микрофиламентов.
Обсуждение. В разделе обсуждаются общие особенности бурс и их наконечников, наконечники классифицируются по типам, приводятся филогенетические выводы.
Общая характеристика бурс и их склеротизированных придатков. Проведенное комплексное исследование показывает, что все наконечники бурс имеют сходную организацию и, следовательно, ведут начало от общего предкового состояния. Для исследованных склеротизированных придатков, включая клеточные колпачки и вагинальные наконечники, характерны следующие общие признаки: 1) многослойная клеточная структура; 2) образование канала (серии каналов) за счет отростков мезенхимных клеток; 3) склеротизация путем усиления внутриклеточных элементов цитоскелета (актиновых филаментов в точечных контактах).
На ультраструктурном уровне склеротизированные участки наконечников выглядят как электронноплотные образования, составленные из филаментов диаметром 6-7 нм. Вид этих микрофиламентов типичен для актина, что подтверждается также и данными конфокальной лазерной микроскопии с использованием флуоресцентных красителей на основе фаллоидина. У всех изученных на сегодняшний день бескишечных турбеллярий, включая 7 видов, исследованных в настоящей работе, наконечники дают положительную реакцию на актин. Бурсы и их придатки имеют несомненную мезенхимную природу, возникая первоначально как лакуны в паренхиме, не имеющие каких-либо оформленных стенок. В дальнейшем охватывающие бурсу клетки паренхимы специализируются и образуют уже настоящую стенку, отграничивающую полость семенной сумки от окружающих тканей. Клетки стенки бурсы и их дериваты, склеротизированные наконечники, лишены признаков, определяющих принадлежность тканей к эпителиям: они не имеют общей апикально-базальной поляризации и не несут опоясывающих клеточных контактов. Однако, несмотря на свою мезенхимную природу, клетки бурсы вынуждены решать задачи, предназначенные для пограничных тканей - а именно, осуществлять функцию изоляции двух сред друг от друга. Но решают они эти задачи при использовании тех скудных «технических средств», которые могут предоставить мезенхимные клетки, то есть путем образования уплощенных листовидных отростков, которые окружают полость бурсы в виде концентрических слоев (структура «кочана капусты»). Слоистое строение семенной сумки характерно для всех исследованных мной видов, различия касаются в основном положения ядросодержащих участков - иногда они располагаются в самой стенке, а иногда обособляются от нее в виде клеточных колпачков. Считать подобную организацию эпителием было бы, конечно же, неправомерно.
Расположение клеток в виде цепочки (стопки) характеризует все изученные мной наконечники. В некоторых случаях склеротизация ограничена чередующимися клетками (Daku woorimensis, Wulguru cuspidata), оставляя каждую вторую клетку в ряду свободной от актина - эти промежуточные клетки имеют секреторную природу. Брюггеманн (Brьggemann 1985) представлял склеротизированные клетки как имеющие дисковидную или воронковидную форму, однако приведенные в моей работе ультраструктурные данные не подтверждают это утверждение - все клетки наконечника имеют форму подковы, охватывающей лишь часть окружности канала.
Пути формирования скелетных структур у низших билатерий. Настоящая кутикула и кутикулярные образования у плоских червей отсутствуют и поэтому опорные структуры и вооружение могут возникать у них одним из двух путей: в результате развития уплотненного внеклеточного матрикса («псевдокутикула»: Karling 1985) или благодаря усилению элементов цитоскелета - актиновых микрофиламентов, поперечно-исчерченных фибрилл или микротрубочек (Rieger & Doe 1975; Doe 1986a, b; Brьggemann 1986; Rieger et al. 1991 и др.)
С этой проблемой сталкиваются и бескишечные турбеллярии. Однако особенности их организации накладывают на них еще большие ограничения. Объем внеклеточного матрикса у Acoela крайне незначителен, и в таких условиях наиболее приемлемым решением проблемы формирования опорных структур и органов вооружения является использование внутриклеточных ресурсов, включающих, прежде всего, элементы цитоскелета. У ряда бескишечных турбеллярий склеротизированные структуры возникают на основе соединенных поперечными сшивками микротрубочек (стилеты совокупительных органов Childiidae: Tekle 2006; Tekle et al. в печати) или посредством развития поперечно-исчерченных фибрилл, вероятно, гомологичных корешкам локомоторных ресничек (стилет Philocelis cellata: Brьggemann 1986). У других бескишечных турбеллярий склеротизация, по-видимому, протекает за счет формирования сети актиновых филаментов.
Какими путями возникают скелетные структуры на базе фибриллярного актина? Логично предположить, что появляются они не на “пустом месте”, но развиваются на основе тех систем, которые уже представлены в клетках. Такие внутриклеточные источники актина должны удовлетворять двум основным критериям: во-первых, микрофиламенты должны объединяться между собой поперечными связками (например, посредством таких промежуточных белков как фимбрины или валлины), и, во-вторых, часть микрофиламентов должна быть ассоциирована с плазматической мембраной. Существует два типа внутриклеточных структур, удовлетворяющих перечисленным критериям - пучки осевых филаментов в микроворсинках, и актин, связанный с клеточными контактами (опоясывающие контакты и терминальная паутина в эпителиях и точечные контакты в клетках паренхимы).