Реферат: Використання аналітичних органічних реагентів у розподільній рідинній хроматографії

Використання аналітичних органічних реагентів у розподільній рідинній хроматографії

Міністерство освіти і науки України

Дніпропетровський національний університет ім О. Гончара

Хімічний факультет

Кафедра аналітичної хімії

РЕФЕРАТ

з теми

«Використання аналітичних органічних реагентів у розподільній рідинній хроматографії»

Виконала: студентка гр. ХФ-09-3м

Кулик Г. С.

Дніпропетровськ 2009

1. Рідинна хроматографія

Цей вид хроматографії був першим серйозно вивченим хроматографічним аналітичним методом, призначеним для виділення природних з'єднань, таких, як рослинні пігменти з розчинів. У старому варіанті РХ являла собою скляну колонку розміром, як правило, 1 на 30 см заповнювали гранульованим твердим матеріалом і пропускали через неї елюєнт - рідину-носій, що містить пробу. Основна незручність такого методу поділу - його мала швидкість. Для досягнення якісного поділу колонку заповнювали зернами малого розміру, то під дією тільки сили тяжіння швидкість елюювання (проходження елюєнта через колонку) могла знизитися до декількох крапель у хвилину. Очевидний спосіб збільшення пропускної здатності колонки складається у використанні нагнітального насоса або тиску газу. Основна перевага рідинної хроматографії перед газовою - можливість здійснювати поділ при більш низьких температурах, інтервал яких обмежується лише точками кипіння й замерзання розчинника. Це означає, що рідинна хроматографія дозволяє розділяти термічно нестійкі з'єднання, наприклад білки, які не можна випарувати без руйнування.

У якості одного із прикладів застосування сучасної РХ розглянемо поділ нуклеозидов. До 1967 р. чіткий поділ уридина, гуанозина, аденозина й цитидина на колонці діаметром 6 мм при тиску від 10 до (10-20) 108 кпа тривало 1 годину. Два роки потому для аналогічного поділу на колонку діаметром 1 мм при тиску 400-108 кпа було потрібно всього 24 хв, а в 1970 р. для такого ж поділу у такій же колонці при тиску 5000 108 кпа досить 1,25 хв. На рис. 1 наведена технологічна схема багатоцільового рідинного хроматографа.

Рис. 1. Технологічна схема типового рідинного хроматографа із пристосуванням для градієнтного елюювання

Два резервуари з розчинниками, А и Б, дозволяють одержувати суміші розчинників, які використовуються в якості рухливої рідкої фази. Кожний резервуар пов'язаний з камерою знегажування, де шляхом нагрівання з розчинників видаляють розчинене повітря, що у противному випадку може викликати появу пухирців у колонці. Спеціальний кран дозволяє подавати на стовпчик один з розчинників або їх суміш у будь-якій пропорції. Краном цим можна управляти так, щоб співвідношення обсягів розчинників мінялося поступово по ходу хроматографічного поділу. Ця методика відома за назвою градієнтного елюювання.

Із крана-змішувача рідина під високим тиском надходить у хроматограф, поміщений у термостаті. Спочатку рідина проходить через змійовик, де вона приймає робочу температуру, а потім через предколонку з такою ж насадкою, що й у основної колонки. Використання предколонки гарантує досягнення рівноваги між рухливою фазою й насадкою аналітичної колонки. Вона також виконує роль фільтра, що видаляє будь-які домішки, що залишилися.

Елюент із колонки проходить через вимірювальну комірку диференціального детектора до колектора фракцій або зливу. Потік елюента, що проходить через порівняльну комірку детектора, відокремлюють від основного потоку елюенту до уведення в нього проби. У більш простих і більш дешевих системах контроль температури не передбачений, і відповідно відсутній змійовик, показаний на схемі. Іноді не використається й предколонка, і не завжди виявлення здійснюється диференціальним детектором.

Насоси. Високий тиск, необхідне для просування рухливої фази по колонці з достатньою швидкістю, можна одержати за допомогою керованого мотором насоса або за допомогою стисненого повітря або азоту, що надходить із балона. В останньому випадку потрібна мембрана або поршень для запобігання прямого контакту газу з рідиною, тому що в противному випадку величезна кількість газу могло б розчинитися й викликати появу пухерців у колонці або детекторі.

Частіше застосовують поршневий або одноходовий насос, тобто фактично шприц великої ємності, керований мотором. Більшість детекторів, застосовуваних у РХ, чутливі до зміни параметрів потоку, тому насос повинен нагнітати рідину з постійною швидкістю без пульсацій. Для виконання цієї вимоги застосовуються різні дотепні методи. Один з них передбачає використання двох циліндрів і поршнів: у той час як один із циліндрів швидко заповнюється, інший, повільно звільняється, а потім ролі їх міняються, після чого весь цикл повторюється.

Колонки. Колонки для РХ звичайно виготовляють зі сталевих (нержавіюча сталь) трубок внутрішнім діаметром від 2 до 5 мм і довжиною від 10 до 30 див. З'єднання колонок виготовляють із гнучких трубок з нержавіючої сталі зовнішнім діаметром порядку 1,5 мм.

.1 Види рідинної хроматографії

.1.1 Рідинно-твердофазна хроматографія (РТХ)

У даному варіанті РХ утримання компонентів проби обумовлено їхньою адсорбцією на гідроксильних групах субстрату - силікагелю або оксиду алюмінію. Полярні молекули втримуються сильніше, ніж неполярні, і звичайно спостерігається наступний порядок елюювання: насичені вуглеводні (невеликі k') < олефіны < ароматичні вуглеводні ~ органічні галогеніды < сульфіди < прості ефіри < нітросполуки < складні ефіри ~ альдегіди ~ кетони < спирти ~ аміни < сульфони < сульфоксиди < аміди < карбонові кислоти (більші k'). Символом k' позначений коефіцієнт ємкості. Сила адсорбції звичайно є характеристикою функціональних груп органічних сполук, тому цей метод особливо корисний для поділу з'єднань різних класів. Можуть позначатися й стеричні ефекти, так що в ряді випадків можна здійснити поділ на геометричні ізомери, наприклад цис і транс.

Активність адсорбенту можна знизити, вводячи в рухливу фазу невелику кількість води. Молекули води селективно адсорбуються на найбільш активних центрах, залишаючи якусь кількість менш активних центрів незайнятими. У результаті лінійна область для органічних сполук помітно розширюється.

.1.2 Рідинно-рідинна хроматографія (РРХ)

Цей різновид хроматографії відомий також як розподільна хроматографія. Тут ми розглянемо системи, у яких гранульований твердий матеріал служить тільки підкладкою нерухомої фази, зовсім як у ГЖХ, а рухливою фазою є друга рідина. Оскільки ці дві рідини не повинні змішуватися, вони повинні помітно розрізнятися по ступені полярності. Фіксувати можна й більш полярну, і менш полярну рідину. Звичайно полярний розчинник, наприклад спирт або воду, наносять на пористу підкладку із силікагелю, оксиду алюмінію або силікату магнію. Неполярний розчинник може втримуватися на тих же субстратах після їх силанізації, після проведення якої вони стають гідрофобними. Такі системи прийнята називати розподільними хроматографічними системами зі зверненими фазами. На рис. 2 показані дві хроматограми, отримані при аналізі суміші ефірів фталевої кислоти за допомогою хроматографії з нормальними й зверненими фазами. Зверніть увагу, що час відкладений у протилежних напрямках (рис. 2,а й б); зроблено це для того, щоб підкреслити зміну порядку елюювання.

Рис. 2. Хроматограми пластифікаторів на основі ефірів фталевої кислоти дибензилфталата (1), децилбензилфталата (2) і дидецилфталата (3), отримані методом РРХ з нормальною фазою (а) і зверненою фазою (б) . Зверніть увагу на протилежний напрямок шкали часу. а: прилад Варіан аерограф 4000; колонка 50 см на 2,4 мм, 1 % ОДПН на лускатому силікагелі; рухлива фаза ізооктан; об'ємна швидкість 25,2 мол/ч; УФ-детектор; б: прилад Варіан аерограф 4100; колонка 50 смХ Х2,1 мм, порасил С с хімічно щепленим октадецилсиланом; рухлива фаза від 30 % СНзОН у Н20 до 50 % СНзОН у Н20 зі швидкістю 4,2 %/хв; об'ємна швидкість 40 мол/хв; Уф-детектор.

Важлива перевага РРХ у порівнянні із РТХ полягає у тому, що нерухому рідку фазу можна міняти, не прибігаючи до перенабивання колонки. Однак легкість видалення рідкого покриття обумовлює й можливість його вимивання.

1.1.3 Рідинна хроматографія на хімічно щеплених нерухомих фазах

У цьому виді хроматографії використають ті ж типи насадок, що й у відповідному варіанті ГХ. Поділяюча здатність колонок даного типу порівнянна з аналогічною характеристикою колонок для РРХ. Колонка першого типу коштують дорожче, однак вони витісняють останні, оскільки вимивання з них нерухомої фази практично виключено.

.1.4 Іонообмінна хроматографія. Іонні смоли для хроматографії

Іонообмінні смоли являють собою високополімерізовані структуровані органічні матеріали, що містять велике число кислотних або основних груп. Хоча смоли нерозчинні у воді, їхні активні групи гідрофільні й мають різний ступінь спорідненості до іонів у розчині. Чотири існуючі типи смол і деякі приклади їхнього застосування перераховані в табл. 1.

Табл. 1. Іонні смоли для хроматографії

Важливе значення має величина робочого інтервалу рН. При рН нижче 5 слабокислотні смоли дисоційовані так мало, що обмін катіонів практично не відбувається. Те ж справедливо для слабоосновних смол при рН вище 9.

Для ілюстрації багатобічних можливостей іонообмінної хроматографії розглянемо три приклади. Спочатку обговоримо поділ простих катіонів на сильнокислотному іонообміннику. Відносна спорідненість однозарядних іонів змінюється в ряді Li+<H+<Na+<NH4+<K+<Rb+<Cs+<Ag+<Tl+ (тобто найменш міцно на смолі втримується Li+). Аналогічний ряд для двозарядних катіонів виглядає так:

+<Mg2+<Zn2+<Co2+<Cu2+<Cd2+<Ni2+<Ca2+<Sr2+<Pb2+<Ba2+

Рис. 3 демонструє повний поділ Na+ і К+. Пробу вводили в колонку і елюювали 0,7 М соляною кислотою. Штриховою лінією показані криві, розраховані виходячи з розподілу Гаусса. Середня величина ВЕТТ становила 0,5 мм.

Рис. 3. Поділ іонів натрію й калію методом ІОХ на катіоніті дауекс-50 при елююванні 0,7 М НС1

Наступний приклад (рис.4) - поділ іонів ряду перехідних металів на сильноосновному аніонообміннику.

Рис. 4. Поділ декількох перехідних металів методом ІОХ на аніонообмінній смолі дауекс-1 при елююванні НС1 з постійно зменшуваною концентрацією

Смолу попередньо перевели в С1- форму, обробивши 12 М соляною кислотою. Уведену в колонку пробу елюювали послідовно усе більше розведеними розчинами соляної кислоти. Іони Ni (II) зовсім не втримуються навіть із концентрованої НС1. Розведення розчину НС1 до 6 М приводить до елюювання іонів Мn (П); іони Со (II), Сu(II), Fe(III) і Zn (II) елюються при концентрації НС1 4, 2,5, 0,5 і 0,005 М відповідно. Ця послідовність э елююванням відбиває відносну стійкість хлоридных комплексів у реакціях типу СоС142- = Со2+ + 4С1-, а також розходження в спорідненості смоли до зазначених іонів і хлорид-іона.

Іонообмінна хроматографія - дуже якісний спосіб поділу сумішей біохімічних важливих з'єднань. За допомогою паралельно встановлених колонок з аніоно- і катіонообмінниками був здійснений поділ більш ніж 100 компонентів сечі.

.1.5 Іон-парна хроматографія (ІПХ)

Цей особливий вид РРХ звичайно застосовується для поділу здатних до іонізації з'єднань, що складаються з катіона С+ і аніона А-, кожний з яких розчинний у воді, у той час як іонна пара С+А- розчинна тільки в неводному розчиннику. Колонки для ІПХ можуть бути заповнені твердим носієм з нанесеної або хімічно щепленою нерухомою рідкою фазою.

Поділ методом ІПХ можна проводити й на нормальних, і на звернених фазах. ІПХ - дуже ефективний метод поділу карбонових або сульфонових кислот (при використанні в якості противоіону іона тетраалкіл-амонію), а також амінів (у присутності перхлорату в якості противоіону).

.1.6 Молекулярні сита й гель-проникна хроматографія

Терміном молекулярне сито називають клас високопористих природніх і синтетичних кристалічних матеріалів, включаючи цеоліти, у яких всі пори мають приблизно однакові розміри. Синтетичні матеріали цього класу випускають у гранульованому виді з діаметром пор від 0,4 до 1,5 нм, тобто того ж порядку, що й розміри органічних молекул з малою молекулярною масою. Молекули, розміри яких менше, ніж діаметр пор, легко дифундують усередину гранул і міцно адсорбуються там, а молекули більшого розміру в пори взагалі не попадають.

Ситові матеріали, використовувані в колонках, забезпечують ефективне видалення маленьких молекул з потоку, дозволяючи більшим молекулам безперешкодно проходити через стовпчик. Молекулярно-ситовий ефект одержав поширення й у хроматографії, зокрема в методі, що одержав назву гель-проникна або гель-фільтраційна хроматографія (ГПХ або ГФХ). Нерухома фаза складається із гранул пористого полімерного матеріалу, найчастіше це вже згадуваний раніше кополімер стиролу й дивінілбензола (ПС-ДВБ) і різноманітні поліакриламідні гелі. Ці матеріали мають пори набагато більших розмірів, ніж цеоліти, і перед використанням їх варто привести в стан рівноваги з розчинником, обраним у якості элюєнта. Розчинник викликає значне набрякання часток, що служить характерною ознакою гелю. На рис. 5 наведена типова хроматограма, отримана методом ГПХ. Зверніть увагу, що першим елююється сполука з найбільшою молекулярною масою, оскільки вона не втримується гелем.

Рис. 5. Хроматограма стандартної суміші полістиролів у толуолі, отримана методом ГПХ (Waters Associates). Відзначено молярні маси, що відповідають окремим пікам. Уведено 75 мкл стандартної суміші; 4 колонки 30 см на 7,6 мм (внутр. діаметр) з х-стирагелем, 104 А; тривалість аналізу 10 хв; температура навколишнього середовища; обсяг сифона 2 мл

.1.7 Градієнтне елюювання

Дотепер ми розглядали лише ізократичні методи хроматографічного поділу, тобто такі методи, у яких елюювання ведеться тільки однією рідкою фазою. Ізократичні методи досить зручні для поділу подібних речовин, коли можна оптимізувати умови шляхом відповідного підбора нерухомої й рухливої фаз. Однак для поділу складних сумішей, компоненти яких можуть сильно розрізнятися по ступені полярності, ці методи не цілком придатні. Час втримання різних компонентів (або величини k') занадто різнорідний, так що перші їхні піки, як правило, групуються поблизу стартової точки, а останні піки настільки збільшуються, що їх важко виміряти точно.