Реферат: Використання аналітичних органічних реагентів у розподільній рідинній хроматографії

Вищезгаданий метод дає дуже гарний поділ хондроітин-4-сульфату, хондроітин-6-сульфату й дерматансульфату. Тому що хлорид цетилпіридинію кристалізується при температурі близько 20-22°С (залежно від партії), то температура элююємих розчинників, що містять хлорид цетилпіридинію, повинна бути вище цієї температури; елюювання варто виконувати також при температурі вище зазначеної. Це особливо важливо для одного з варіантів методу, що використає хлорид цетилпіридинію, у якому елюювання виконують при збільшенні концентрації нейтральних солей без введення органічного розчинника. Експериментально процес здійснюють аналогічним образом. Елюювання мікроколонки східчасто наступними рухливими фазами (порції по 1 мл):

) 1%-вий розчин хлориду цетилпіридинію;

) 0,5 М розчин хлориду натрію в 0,5%-вим розчином хлориду цетилпіридинію;

) 0,7 М розчин хлориду магнію в 0,05%) -вим розчином хлориду цетилпіридинію;

) 1,25 М розчин хлориду магнію в 0,05%-вим розчином хлориду цетилпіридинію;

) 6 Н розчин соляної кислоти.

Під час поділу елюювання гіалуронової кислоти 0,5 М розчином хлориду натрію (розчинник 2), хондроітинсульфату - 0,7 М розчином хлориду магнію (розчинник 3) і гепаринів - 1,25 М розчином хлориду магнію (розчинник 4). Вихід витягнутого продукту становить 80-100% незалежно від складу аналізованої суміші. Якщо цей метод виявляється непридатним для поділу хондроітин-4-сульфату й хондроітин-6-сульфату, перевагу звичайно віддають методу в якому використовують хлорид цетилпіридинію з органічними розчинниками.

.3 Поділ на дауексі 1-Х2 (С1)

Поділ у макромасштабі виконують на колонку 0,9 на 44 см, наповненої дауэксом 1-Х2 (Сl-; 200-400 меш). Аніоногенний глікозаміноглікан (5-10 мг) застосовують у вигляді водяного розчину, завантажену колонку промивають дистильованою водою й застосовують східчасте градієнтне элюювання розчином хлориду натрію з концентрацією, що збільшується. Цей метод дає поділ гіалуронової кислоти, гепаринсерсірчаної кислоти, хондроітин-4-сульфату й гепарину. Кератансульфат элююється 3 М розчином хлориду натрію й може бути також повністю виділений.

В удосконаленому варіанті цього методу можливе проведення процесу в мікромасштабі. Для поділу 3-5 мкМ кожного глікозаміноглікану беруть 400 мг дауэкса 1-Х2 (100-200 меш) на колонку і елюювання виконують із застосуванням лінійного сольового градієнта в 8 М розчині сечовини. Крім того, сечовина зменшує до мінімуму не електростатичні зв'язки білків з іонітами на основі целюлози. Присутність 8 М розчину сечовини в сольовому градієнті зрушує хроматографічні зони глікозаміногліканів убік більше низьких утримуваних обсягів, указуючи тим самим, що під час відсутності сечовини значну роль у процесі поділу грають гідрофобні зв'язки. У присутності сечовини піки краще розширюються, що свідчить про те, що не електростатичне зв'язування перешкоджає процесу поділу. Поділ мікрокількостей глікозаміногліканів на дауексі 1-Х2 є, згідно даним деяких дослідників, кращим класичним варіантом методу, що використає хлорид цетилпіридинію (без органічних розчинників).

молекулярний ефір гель хлорид

5.4 Поділ на ECTEOLA-целюлозі

Цей метод, розроблений Рингертцом і Рейхардом, згодом був розвинений іншими дослідниками. Поділ гіалуроновой кислоти, сульфатів хондроітину й гепарину можливий на колонці, наповненію ECTEOLA-целюлозою, із застосуванням елюювання з концентрацією хлориду натрію в розведеній соляній кислоті, що збільшується. У роботі використовувався східчастий градієнт для поділу гіалуронової кислоти, хондроітин-4-сульфату, хондроітин-6-сульфату, дерматансульфату й кератан-сульфату. Взагалі галактозаміноглікани можна елюювати з колонки розчином мурашинокислого амонію в аміаку більше низької концентрації, чим потрібно для кератансульфату.

.5 Поділ на DEAE-целюлозі

Хоча в роботі повідомлялося, що при хроматографії на DEAE-целюлозі піки індивідуальних глікозаміногліканів близько один до одного й що цей іоніт не може бути рекомендований для поділу, проте Бразельман і Рамм розвили цей метод, у результаті чого був досягнутий досить якісний поділ. Так, у методі, що використовує хлорид цетилпіридинію елюювання виконували розчином хлориду магнію з концентрацією, що збільшується. У цьому методі можна використати маленькі колонки (50X Х4,5 мм), і в цілому потрібно не більше 50 мг речовини (рис. 9). Очевидно, що в цьому випадку поділ хондроітин-6-сульфату, хондроітин-4-сульфату й дерматансульфату є неповним, але сульфат гепарину й гиалуроновая кислота розділяються чітко.

Рис. 9. Поділ глікозаминогліканів на DEAE -целлюлозі: А - глікозаміноглікани з аорти кролика (43,4 мг); Б - ті ж глікозаміноглікани, оброблені гіалуронідазою; В - зразки; ГК - гіалуронова кислота; Х-4-С - хондроітин-4-сульфат; ДС - дерматансульфат; Х-6-С - хондроітин-6-сульфат; Ге - гепаринів

У цьому методі, як і в багатьох інших у хроматографії глікозаміногліканів, використовувався східчастий градієнт. Елюювання починають виконувати 0,2 М розчином хлориду магнію в 0,002 М розчині оцтової кислоти, що сприяє виділенню гіалуронової кислоти. Цю стадію використовують і в декількох інших аналогічних методах. Таким чином, переваги й недоліки хроматографії на DEAE-целюлозі можна сформулювати в такий спосіб. Продуктивність колонки досить висока, отже, цей метод більше підходить для препаративних цілей, чим для аналітичних. Цей метод також дозволяє витягати глікозаміноглікани із сильно розведених розчинів, які утворюються при роботі із природними речовинами. У деяких випадках сахаридні речовини сильно втримуються іонітом, що є причиною утворення «хвостів» і заважає поділу. Відповідно до роботи ці труднощі можуть бути переборені, якщо використати шари, що чергуються, DEAE-целюлози й деяких інших іонітів. Бразельман і Рамм думають, що ці перешкоди не є результатом виникнення гідрофобних зв'язків, як повідомляли раніше деякі дослідники для випадку дауекс 1-Х2, оскільки застосування сечовини виявилося неефективним для хроматографії на DEAE-целюлозі. При поділі на природній DEAE-целюлозі, звичайно, не можна застосовувати органічні розчинники, які використовувалися при поділі за допомогою хлорид цетилпиридиния.

.6 Поділ на DEAE-сефадексі

Для цих цілей Шмидт застосовував колонку розміром 20x2 см, наповнену сефадексом А-25 (Сl-). Після попередньої обробки 0,5 М розчином їдкого натру, 0,5 М розчином соляної кислоти й 0,1 М розчином хлориду натрію колонка наповнювалась суспензією іоніту в 0,1 М розчині хлориду натрію. Потім використали наступний східчастий градієнт:

) 0,50 М розчин хлориду натрію;

) 1,25 М розчин хлориду натрію в 0,01 М розчині соляної кислоти;

3) 1,50 М розчин хлориду натрію в 0,01 М розчині соляної кислоти;

4) 2,0 М розчин хлориду натрію в 0,01 М розчині соляної кислоти.

Перед початком процесу колонку промивали 5 мл дистильованої води. У процесі поділу збирали фракції по 5 мл. Ізомерні хондроітинсульфати не піддавалися поділу таким методом, і вони елюювались одним піком.

.7 Хроматографія на гелі сефадекса й розподіл по молекулярних масах

Існують хвороби, при яких порушується обмін аніоногенних глікозаміногліканів, і деякі аніоногенні глікозаміноглікани можуть акумулюватися в органах і тканинах або можуть видалятися із сечею. Є дані про те, що ці глікозаміноглікани відрізняються від своїх аналогів здорових організмів по ступені полімеризації. Більшість методів, відмінних від хроматографії, займає занадто багато часу, щоб мати практичну цінність. Зразок хондроітин-4-сульфату при хроматографуванні на колонці із сефадексом G-200 давав широкий пік, що відповідає безліч полімерам, які є у зразку. Із цієї фракції виділяли вузькі фракції й визначали молекулярні маси з'єднань у кожній з них будь-яким підходящим методом, наприклад таким, як метод визначення коефіцієнта дифузійного осадження (результати зненацька показали, що ці фракції не занадто відрізняються по молекулярних масах), і вичерчували залежність утримуваних обсягів від знайдених молекулярних мас. Все вищевказане необхідно здійснити у зв'язку з тим, що відсутня ідентичність залежності логарифма молекулярної маси від відносного часу втримання, отриманої цим методом, і аналогічного каліброваного графіка будь-якого стандартного білка. Перевага цього методу полягає в тому, що дерматансульфат, хондроітин-б-сульфат і гепаритинсульфат також підкоряються цієї залежності

6. Застосування органічних реагентів у рідинній хроматографії для поділу глікопротеінів і глікопептидів

Методи хроматографічного поділу гликопротеінів фактично не відрізняються від методів, використаних у хімії білків і пептидів. Також є ряд білків, які у звичайному змісті не вважаються глікопротеінами, хоча вони містять один або трохи глікозидних залишків. Звичайно, існує безліч методів, за допомогою яких можуть розділятися різні глікопротеіни. З погляду хроматографіста, тут не треба детально їх описувати. З іншої сторони є хроматографічний метод, специфічний для структурних аналізів глікопротеінів і глікопептидів. Специфічність заснована на виборі підходящої системи детектування, а не властиво методу поділу.

Вуглеводи і їх ацил- і алкілоксіпрпохідні взаємодіють із фенолом і сірчаною кислотою, даючи жовто-жовтогарячий хромоген, що проявляє абсорбційний максимум при довжині хвилі 485 нм для пентоз або при 489 нм для гексоз. Крім того, у роботі повідомлялося, що амінокислоти й білки не заважають цій реакції. Тому що цей метод є простим і чутливим і не вимагає спеціального очищення після того, як змішані реагенти, використані для утворення жовтого хромогену; він був обраний для аналізу великої серії зразків, отриманих при протеолітичних виварюваннях глікопептидів.

7. Застосування рубіановодневої кислоти в трибутилфосфаті, як нерухома фаза в колоночній хроматографії

Різні хелатоутворюючі реагенти, такі як дитізон, оксихінолін, купферон, найбільше часто використовують для групового концентрування іонів металів з вод. Недоліки екстракційних методів концентрування полягають у значній розчинності хелатоутворюючих реагентів і їхніх комплексів у воді, необхідності повторення екстракції з більших обсягів (500-750 мл) аналізованої проби, у результаті чого виходять значні обсяги екстрактів, з яких реекстрагують елементи, або відганяють органічний розчинник. Це подовжує час аналізу, ускладнює його виконання, зменшує точність визначення мікроелементів.

Спосіб концентрування іонів кобальту, міді, цинку, свинцю, кадмію й марганцю методом екстракційної хроматографії описаний по розробках В. А. Лугініна. Він складається в пропущенні через хроматографічну колонку аналізованої проби води обсягом від 0,5 до 10 л із рН = 7,0 зі швидкістю 2 л/год. Колонка заповнена ацетилцеллюлозою з висотою прошарку, на яку нанесена органічна фаза - розчин дитизона в четирихлористому вуглеці.

Через скляну колонку, заповнену порошком фторопласту - 4 з висотою прошарку 10 мм із нанесеним на нього 0,1 М розчином оксихіноліну в суміші ізоамілового спирту й чотирихлористого вуглецю, пропускають 20 мл аналізованої проби рН = 7, попередньо насиченої оксихіноліном, зі швидкістю 0,4-0,5 мл/хв. Обмеженість застосування екстракційної хроматографії для концентрування іонів металів з вод, імовірно пояснюється двома обставинами: з одного боку, значна розчинність застосованих хелатоутворюючих екстрагентів у воді обмежує обсяг досліджуваного розчину, що пропускається через колонку, або вимагає попереднього насичення всіх минаючих через колонку розчинів відповідним реагентом; з іншого боку, звичайно, застосовані для екстракції хелатні органічні розчинники (хлороформ, чотирихлористий вуглець) слабко втримуються твердими носіями нерухомої фази, тому необхідно застосовувати колонку з великою висотою прошарку носія, або часто відновляти органічну фазу.

Вибір як нерухома фаза розчину рубеановодневої кислоти (РВК) у трибутилфосфаті (ТБФ) пояснюється наступним. РВК відноситься до хелатоутворюючих реагентів, які звичайно використовуються для групового концентрування, але на відміну від них має незначну розчинність у воді . Як розчинник для РВК використаний нерозбавлений ТБФ. Це дозволило одержати розчин хелату в розчиннику, що у достатній кількості втримувався на носії - поліхромі. Експериментально оцінена розчинність РВК у ТБФ, що становить 0,2±0,01 моль/л. Дослідження стійкості реагенту на колонці показало, що при пропущенні 500 мл води, що має рН=9, реагент повністю залишається в колонці. Максимально при обраній висоті прошарку носія (близько 8 см) через колонку можна пропускати близько 5 л води, після чого необхідно відновити органічну фазу.

Вивчення повноти екстракції кожного елементу на колонці проводили з розчинів із рН 9,0, оскільки це значення рН відповідає оптимальним умовам утворення рубеанатів більшості елементів. Необхідне значення рН установлювали додаванням аміаку. Контроль за змістом досліджуваних іонів здійснювали у фільтраті після розпарювання й в елюенті після реекстракції розчином соляної кислоти (1:1).

Іони заліза й марганцю в слаболужній області перебувають у вигляді різних малорозчинних гідратів, не утворюючи рубеанатів, і повинні затримуватися колонкою, що відіграє роль пористого фільтра. Це підтверджувалося в такий спосіб: розчини, що містять 10-50 мкг/л кожного елемента окремо доводили аміаком до рн 9,0 і пропускали через колонку, наповнену сухим поліхромом без нанесення на нього органічної фази. При цьому в колонці залишалося 80-90% заліза й 40-60% марганцю. Після нанесення на поліхром ТБФ обидва елементи не були виявлені у фільтраті, повністю залишалися в колонці. Іони міді, нікелю й кобальту сорбувались в колонці, утворюючи рубіанати, наявність яких можна легко виявити по зміні фарбування верхнього шару носія. Рубіанати разом з нерухомою фазою вимивали з колонки диметилформамідом (ДМФ) і знімали спектри поглинання отриманих розчинів на спектрофотометрі СФ-4А. Розчином порівняння служив розчин РВК і ТБФ, розведений ДМФ і не утримуючий хелатів металів. Як видно з рис. 10, введення в розчин РВК у ТБФ рубіанатів досліджуваних іонів дає в спектрах характерні смуги поглинання. Однак максимуми поглинання трохи зміщенні в довгохвильову область спектру в порівнянні зі спектрами рубіанатів водяних розчинів. На цьому ж малюнку показаний спектр екстракту, що містить іони цинку. У цьому спектрі також є характерний максимум, що може бути віднесений до рубіанату цинку, однак раніше в літературі це не підтверджувалося, а висловлювалося припущення про те, що продуктом взаємодії цинку із РВК можуть бути малорозчинні сульфіди. Крім зазначених елементів досліджувалось також екстракційно-хроматографічна поведінка галію, титану, вісмуту, кадмію, алюмінію й свинцю. За винятком кадмію й вісмуту, які концентрувалися на 80-90%, всі інші елементи на 95-100% затримувалися в колонці.

Рис. 10. Спектри поглинання розчинів: РВК+ ТБФ + ДМФ - 1 ; те ж + рубіанат нікелю - 2 ; те ж + рубіанат кобальту - 3; те ж + рубіанат міді - 4; те ж + рубіанат цинку - 5

Рис. 11. Схема роздільного послідовного елюювання заліза - 1; марганцю - 2; кобальту - 3; міді - 4; нікелю - 5

Элюювання іонів із колонки також являє не завжди просте завдання. Досліджувалися два варіанти реекстракції: одночасне групове елюювання всіх сорбованих іонів і послідовне роздільне элюювання п'яти основних елементів - заліза, марганцю, кобальту, міді, нікелю. При вивченні можливості швидкої реекстракції всіх сорбованих елементів виходили з того, що рубіанати утворюються в слаболужному середовищі й руйнуються в кислотах. У результаті попередніх випробувань для одночасного елюювання всіх іонів обраний розчин соляної кислоти (1:1). При цьому залізо, кобальт, марганець, мідь, нікель, титан, алюміній, галій елюються в перших п'яти - сіми вільних обсягах кислоти; в 10 - 15 вільних обсягах елюються цинк, кадмій, вісмут, свинець. Таким чином, промиваючи колонку 25-30 мл HCI (1:1), можна повністю перевести у водну фазу всі сорбовані іони.

В основу розподільного елюювання покладене варіювання концентрації й природи мінеральної кислоти. При цьому для кожного елюєнту вивчалося поведінка не тільки того іона, для якого даний розчин був елюентом, але й всіх наступних за порядком виходу з колонки.