Реферат: Використання аналітичних органічних реагентів у розподільній рідинній хроматографії

Целюлозу ватман № 1 (а іноді також ватман CF-11 або CF-12 ) звичайно використають для поділу в препаративних масштабах моно- і олігосахаридів і деяких їхніх полярних похідних. На мікрогранульованій целюлозі поділ анітрошки не поліпшується, тому що вона має тенденцію до занадто щільного заповнення колонки, у результаті чого швидкість рухливої фази зменшується. Для одержання колонок з якісними характеристиками поділу велике значення має метод її заповнення.

Для кількісної хроматографії олігосахаридів використовувалась колонка 45 на 1,5 см, наповнена порошком целюлози CF-12 на висоту 43 см.

Потім, після відстоювання, рідину разом із дрібними частками декантиювали й це повторювали п'ять разів. Колонку наповнювали суспензією з 50 г целюлози (звільненої від дрібних часток) в 800 мол води при 90 °С. Потім під дією власної ваги целюлоза осідала й ущільнювалася в колонку, а надлишок води видаляли через вихідний отвір. Цю процедуру повторювали доти, поки колонка не заповниться до заданої висоти. Правильно заповнена колонка повинна мати об'ємну швидкість потоку 30-40 см/год. Воду потім видаляли, пропускаючи через колонку принаймні 500 мл суміші, що містить воду - етанол - бутанол (24,5:23:52,5).

.3 Хроматографія на іонообмінних смолах

Останнім часом хроматографія на целюлозі заміняється розподільною хроматографією на іонообмінних смолах з різними противоіонами, що допускає значно більшу розмаїтість умов експерименту. В колонці виникає нерівномірний розподіл компонентів розчинника між смолою й зовнішнім розчинником. Наприклад, у випадку водного етанолу відносна кількість присутньої води буде більше в смолі, ніж у зовнішньому розчиннику; це пояснює, чому смола переважно втримує полярні розчинені речовини.

Катіонообмінні смоли мають перевагу перед аніонообмінними смолами, тому що в промисловості вони легко виходять у вигляді дрібних однорідних часток (завдяки чому їх використовують в амінокислотних аналізаторах). Найбільше часто використовуються дауекс 50W-X8, амберліт IR-120, амінекс (Aminex) A-6 і технікою (Technicon) T5C, технікою Т4 або дауекс I-X8 з величинами часток у межах 5-20 мкм. У якості противоіонів звичайно використають літій-, натрій-, калій-, барій-, кальцій-, сульфат- і хлорид-іони. З вивчених типів смол найбільш сприятливий поділ багатоатомних спиртів відбувається при використанні літієвої форми.

Останнім часом стали використовувати противоіони органічних сполук, такі, як піперидини і диметил- і триметиламоній. Застосування іона триметиламонію дає оптимальне співвідношення між обсягами втримання, шириною хроматографічних зон і часом аналізів.

Взагалі значення константи об'ємного розподілу Кd для суміші вода - етанол зростає зі збільшенням числа гідроксильних груп у сполуках і зменшується при наявності в них неполярних груп; на величину константи впливає також положення замісника . Величини Кd. помітно збільшуються з ростом концентрації етанолу, але порядок елюювання не залежить від цієї концентрації (у практично значимих межах). Максимум обсягу втримання й ширина хроматографічної зони звичайно зменшуються зі збільшенням температури.

Рис. 8. Розподільна хроматографія альдитолів на дауексі 50W-X8 (Li+; 14-17 мкм): Колонка: 131Х0,26 див; рухлива фаза: 85%-вий розчин єтанолу; швидкість рухливої фази 3 мл/хв • см2; температура 75оС.1 - формальдегід; 2 этиленгліколь; 3 - гліцерин; 4 - эритрит; 5 - рибіт; 6 - арабіт;7 -ксиліт; 8-манніт; 9 - глюцит; 10 - галактит

При дуже високих температурах поділ виявляється скрутним внаслідок зменшення відносної величин Кd сполук, що піддають розподілу.

Причиною, що обмежує застосування цього методу, є надзвичайно низька швидкість дифузії у середину часток смоли. Отже, більш кращим є використання пористих смол і маленьких часток. Для таких часток варто використовувати метод високого тиску для прокачування розчину рухливої фази через колонку. Для того щоб зменшити перепад тиску в колонку, використовують іонообмінні смоли з домішкою целіту 545.

Звичайно, сили взаємодії в системі розчинник - смола й особливі сили взаємодії між багатоатомними спиртами й противоіонами в смолі роблять також сильний вплив на рівновагу в іонообмінній смолі. Зустрічаються й ефекти молекулярного просівання, які в окремих випадках, якщо міняються противоіони, приводять до зміни порядку елюювання.

.4 Хроматографія на силікагелі й окисі алюмінію

При хроматографії в системі рідка фаза - рідка фаза іноді використають як носій силікагель. У цьому випадку як рухлива фаза застосовують етилацетат, що містить диметилсульфоксид або диметилформамід , суміш метанол - вода (7:3) або водно - насичений етилацетат. Якщо використовують розчинник, що містить воду, наприклад насичений водою бутанон, то варто проводити поділ на суміші силікагелю й окису алюмінію (1:1); у такому випадку досягається оптимальна швидкість рухливої фази . Із цієї причини найбільш підходящою рухливою фазою є суміші пропанол-2-хлороформ - аміак - вода в різних співвідношеннях .

.5 Гель-хроматографія

До останнього часу гель - хроматографію використовували майже винятково для поділу цукрів, які відрізняються розмірами молекул, особливо для фракціонування сумішей оліго- і полісахаридів. Однак у деяких роботах, що стосуються досліджень хроматографічних властивостей моносахаридів і їхніх похідних, показано, що відповідні величини Кd зменшуються немонотонно зі збільшенням молекулярної маси й що вони змінюються навіть усередині рядів альдопентоз і альдогексоз. Це явище, що пояснюється розходженнями в стеричних перешкодах для входу молекули цукру в гель нерухомої фази, свідчить про можливості подальшого розвитку гель - проникної хроматографії (ГПХ) для аналізу вуглеводів.

Найбільш часто використовуються зшиті гелі декстрану (сефадекс) і гелі поліакриламіду [серії біогель (Bio-Gel) P]. Завдяки високому опору до термічного, хімічного й бактеріологічного руйнування все зростаюче застосування в цей час знаходять пористе скло [біоглас (Bio-glass)] і пористі кульки двоокису кремнію (порасил). У деяких випадках використовуються й інші типи гелів, такі, як гелі агарози [сефароза (Sepharose), caгароза (Sagarose)], зшитий полістирол, що містить гідрофільні групи [аквапак (Aquapak)], а також іонообменні смоли. Останнім часом повідомлялося про поліпшення хроматографічних властивостей сефадексу G-15, після обробки його 1М розчином соляної кислоти; це приводить до збільшення числа теоретичних тарілок і внутрішнього обсягу, а також до збільшення кількості пор ефективного розміру.

Що стосується впливу умов проведення процесу на ефективність гель - проникної хроматографії, то тут немає серйозних відхилень від звичайної методики; рекомендуються гелі із частками малого діаметра й певним розміром пор, а також довгі колонки з маленьким внутрішнім діаметром і дуже низька швидкість рухливої фази. Найбільш підходящими рухливими фазами для гель - проникної хроматографії цукрів є вода, водяні розчини хлориду натрію й різні буферні розчини.

.6 Іонообмінна хроматографія

Звичайно буває важко вирішити питання про те, чи залежать різні обсяги втримання тільки від властивостей іонообмінних смол. На практиці завжди є деякий ефект поділу внаслідок часткової розчинності або адсорбції з'єднань на матриці смоли, крім того, не можна не враховувати молекулярноситові ефекти.

.7 Хроматографія на іонообмінних смолах у Н+- або ОН+--формах

При поділі кислотних або лужних похідних цукру на іонообмінних смолах важливими факторами є не тільки умови рівноважного обміну (рК розчиненої речовини), але також молярна концентрація іона, що заміщає, рН утворюючого буферного розчину й температура. Передбачається, що розходження в ширині піків не відповідають звичайній картині, що полягає в тім, що чим пізніше даний зразок виходить зі колонки, тим ширше його пік внаслідок розмиву. Такі розходження пояснюються присутністю різних речовин, аномерів і конформерів і відносними швидкостями їхніх взаємних перегрупувань.

Іноді може мати місце також протилежний ефект, так звана іонна заборона, наприклад, для кислих цукрів, які виключаються з матриці біорад AG50W-X2 (Li+), що містить іонизуємі групи, у такий спосіб зменшуючи обсяги втримання.

Передбачається, що у випадку нейтральних похідних цукрів, таких, як глюкозиди, поділ на сильно лужних аніонообмінних смолах є наслідком іонообмінного процесу, що включає втрату протона однієї з гідроксильних груп. Відповідно до цього припущення обсяг утримання пропорційний значенню рК гідроксильної групи, що іонізується першою. Кислотність визначається числом і близькістю інших полярних замісників у молекулі, відносними кутами між диполями й гідроксильною групою, що іонізується. Внаслідок слабкої кислотності гідроксильних груп цукрів вода, використовувана як рухлива фаза, не повинна містити двоокис вуглецю.

.8 Хроматографія на іонообмінних смолах у боратній формі

Аніонообмінні смоли в боратній формі є найпоширенішими смолами серед іонообмінних смол з реакційно здатними противоіонами. Відповідно до цього методу, колонка наповнюється іонообмінною смолою в хлоридній формі й переводиться кілька разів поперемінно із хлоридної у боратну форму. У всіх колонках, приготовлених таким чином, був отриманий кращий поділ сумішей цукрів, чим у колонках, наповнених іонообмінною смолою в хлоридній формі з наступним однократним перекладом її в боратну форму. Цей метод може бути також рекомендований при великому обсязі рухливої фази, що проходе через колонку з високою швидкістю, з метою більш щільного наповнення прошарку смоли.

Кеслер, порівнюючи три аніонообмінні смоли у формі боратів, знайшов, що для поділу вуглеводів технікою 3/28/VI значно ефективніше, ніж дауекс 1-Х8 (200-400 меш) і біорад АС 1-ХВ (30-40 мкм). При використанні смоли з більш низьким ступенем поперечної зшивки, наприклад дауекс 1-Х4, варто враховувати рівновагу, що досягається при збільшені швидкості; крім того, значно поліпшується хроматографічний режим поділу ди- і трисахаридів. При використанні смоли з більш дрібними й більш однорідними по величині частками також збільшується поділяюча здатність, однак найбільш критичним параметром, що впливає на поділяючу здатність, є, імовірно, іонна сила буферного розчину, що проявляє.

Для оптимального поділу моно- і олігосахаридів був використаний наступний лінійний градієнт буферного розчину при об'ємній швидкості потоку 1,15 мл/хв при 50 °С. Він утворювався у двокамерному приладі, що містив 325 мл точно приготовленого буферного розчину (38,9 г Na2B407 • Н20 і 7 г НзВОз на 1 л, рН 8,9) у резервуарі й 325 мл вихідного буферного розчину (перший розчин, розведений у п'ять разів, 0,042М) у змішувальній камері. Вся вода, використовувана для готування буферного розчину, повинна бути деіонізована на змішаному прошарку смол амберліт IRA-400 і дауекс 50-ХВ, обидві 16-50 меш (2:1), щоб початкова питома електропровідність води становила ~0,5-10-6 Ом-1см-1. На поділ близько розташованих (дуплетів) піків у значній мірі впливає зміна іонної сили початкового буферного розчину від 0,035 до 0,046 М, при цьому збільшується або зменшується нахил прямої, що показує зміну буферного розчину. Однак результати змінювалися дуже незначно зі зменшенням рН рухливої фази до 8,45.

Було знайдено, що в результаті збільшення температури колонки часи втримання хроматографічних зон збільшуються. Однак в області температур 55-70 °С подальше поліпшення поділу фактично було відсутнє.

Якщо ширина зон різних цукрів не змінюється при постійних умовах елюювання, то кількість сахариду відповідає висоті піка, вираженої в одиницях поглинання. Коливання у відтворюваності експерименту, тобто в поділяючій здатності системи, пояснюються присутністю забруднень у вигляді металів і силікатів. Неповне перетворення смоли в боратну форму також може приводити до погіршення поділу після повторного наповнення колонки.

Використання не лужних буферних розчинів у боратній формі, таких, як борна кислота - гліцерин або борна кислота - бутандіол-2,3, зводить до мінімуму процеси перегрупування на смолі, що дозволяє досягти чистоти виділюваних сахаридів у межах 85-100% .

.9 Автоматичні методи детектування

Швидкий ріст числа хроматографічних поділів малих кількостей багатокомпонентних (більше 10) сумішей, отриманих із природніх речовин, звичайно обумовлює необхідність використання автоматичних методів контролю елюенту. Звичайно існують два різних способи автоматичних аналізів елюентів, що містять сахариди. Перший спосіб, «неруйнуючий», заснований на дослідженні елюенту фізичними методами. При другому, «руйнуючому», способі сахариди аналізують за допомогою хімічної реакції. Обидва способи використовують головним чином для аналітичних поділів. Для препаративних цілей кожної з елюентів пропускають через кювету, де спостерігають зміни деяких його фізичних властивостей (при неруйнуючому способі не відбувається зміни хімічного складу розчинної речовини), можна також безупинно аналізувати аліквоту елюенту на зміст цукру за допомогою руйнуючої хімічної реакції.

Для препаративних поділів сумішей цукрів, які виконують рідко, переважно використовують фізичні методи, щоб уникнути втрат часу на попередні випробування й калібрування.

Неруйнуючі способи

Ці методи менш чутливі, чим кольорові реакції, однак вони мають переваги, що складаються в легкості проведення експерименту при мінімальній його вартості й високій відтворюваності. Відібрані з елюентом з'єднання можна згодом використовувати; цей спосіб для препаративних цілей, де не потрібно дуже висока кількісна точність.

Обертання площини поляризації

Цей спосіб якісної оцінки полягає у вимірі величини обертання площини поляризації елюенту. Автоматичний поляриметр є зручним і чутливим приладом для реєстрації розділених зон, наприклад при елююванні глюкозидів з колонок, заповнених смолою, де аномірна природа елююємого з'єднання реєструється виміром величини обертання площини поляризації. Для більш складних сумішей, де відбувається часткове перекривання зон, цей метод навряд чи придатний внаслідок широкого спектра значень питомого обертання розглянутих з'єднань. Кількісна оцінка присутніх цукрів можлива тільки для добре поділюваних розчинених речовин, для яких відома величина питомого обертання, причому необхідною умовою є постійна швидкість потоку.

5. Застосування органічних реагентів у рідинній хроматографії для поділу комплексних полісахаридів з білками

.1 Глікозаміноглікани (мукополісахариди)

В основному є два різних методи поділу аніоногенних глікозаміногліканів (мукополісахаридів кислотного характеру). Самий загальний метод клінічних аналізів заснований на селективній дисоціації цетілпірідінієвих комплексів цих з'єднань у розчинах солей різної концентрації. Останнім часом деякі дослідники використовували селективне елюювання в колонках, наповнених такими іонітами, як дауэкс-1, ECTEOLA-целюлоза, DEAE-сефадекс і гелями фосфату кальцію. Поділ проводять на штучних сумішах гіалуронової кислоти, хондроітин-4-сульфату (хондроітинсульфату А), хондроітин-6-сульфату (хондроітинсульфату З), дерматансульфату (хондроітинсульфату В), кератансульфату й гепарину.

Аніоногенні глікозаміноглікани виділяють із тканини шляхом неспецифічного протеолізу білків за допомогою ферменту папаіну (Е. С. 3.4. 4.10). Виварювання звичайно виконується при 65 °С протягом 3 годин.

.2 Метод, що використовує хлорид цетилпіридинію

У стовпчик 60 на 3 мм, що має грушоподібне розширення у верхній частині обсягом близько 4 мл, додавали по 20 мкг кожного полисахариду й використовували східчасте градієнтне елюювання, що включало наступні рухливі фази:

) 1%-вий розчин хлориду цетилпіридинію;

) 0,3 М розчин хлориду натрію у воді, що містить 0,05% -вий розчин хлориду цетилпіридинію;

3) розчин н-пропанол - метанол - оцтова кислота - вода (40:20:1,5:38,5), що містить 0,4%-вий розчин хлориду цетилпіридинію;

) 0,75 М розчин хлориду натрію, що містить 0,05% хлориду цетилпіридинію.

Між введенням розчинників 2 і 3, 3 і 4, 4 і 5 колонку элюювали 0,05%-вим водяним розчином хлориду цетилпіридинію, щоб видалити розчинник, що залишився від попередньої стадії.