Содержание самцов и самок крыс в условиях световой депривации тормозит возрастные изменения большинства показателей биологического возраста и старения, снижает риск развития опухолей и увеличивает продолжительность жизни.
Содержание в условиях естественного освещения Карелии проявляется у самцов и самок крыс неблагоприятным влиянием на биомаркеры старения и гомеостаза, увеличением риска развития опухолей и уменьшением продолжительности жизни.
Применение препаратов эпифиза (мелатонина и эпиталона) оказывает защитный эффект, уменьшает неблагоприятное влияние постоянного освещения, улучшает показатели гомеостаза, замедляет процессы старения и увеличивает продолжительность жизни животных.
Пептидный препарат эпифиза эпиталон обладает более выраженными геропротекторными и антиканцерогенными свойствами, чем мелатонин, в условиях нарушенного светового режима и является перспективным препаратом для исследования в геронтологии и для практического применения в гериатрии, в частности, для коррекции нарушений гомеостаза, возникающих в условиях нарушенного фотопериодизма.
Публикации
По теме диссертации опубликована 61 работа, включая 22 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ для опубликования результатов диссертационных исследований.
Работа поддержана грантами РФФИ 2004-2006 №04-04-49168-а «Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни, возрастную патологию и их фармакологическая коррекция»; РГНФ 2004-2006 № 04-06-00120а «Белые ночи на Европейском Севере - как фактор, нарушающий функцию репродуктивной системы. Возможности фармакологической коррекции»; РГНФ-Север 2004-2006 №04-06-49602 а/с «Модельное исследование адаптационных возможностей организма при изменении циркадианных ритмов в течение годового цикла при проживании в северных климатогеографических зонах»; РФФИ-Север 2005-2007 №05-04-97525-р_север_а «Экспериментальные основы влияния освещенности на гормональный статус и некоторые биохимические показатели в условиях Карелии»; РФФИ 2007-2009 №07-04-00546 «Влияние возраста на динамику адаптационных изменений активности ферментов к различным световым режимам и их фармакологическая коррекция»; РГНФ-Север 2007-2009 № 07-06-42602а/С «Белые ночи на Русском Севере - как фактор, нарушающий возрастную адаптацию водно-солевого обмена. Возможности фармакологической коррекции».
Апробация диссертации
Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных форумах: III, V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003; 2007); III Международной научной конференции "Состояние биосферы и здоровье людей" (Пенза, 2003); II Международном симпозиуме "Проблемы ритмов в естествознании" (Москва, 2004); 11-15 Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 2004; 2005; 2006, 2007, 2008); VI международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2004); V международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2005) XIII международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); Международный симпозиум «Жизнь и работа на Севере» (Костомукша, 2003); 10 симпозиум «Витамины и адаптация» (Йена, Германия, 2005); 4 Интернациональное совещание «Психоэмоциональные, поведенческие и когнитивные расстройства у пожилых - ABCDE» (Болонья, Италия, 2006); 14 Европейский биогеронтологический конгресс (Москва, 2006); Международной конференции «Погода и биосистемы» (СПб, 2006); Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006); Конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (Сочи, 2006); V и VI Европейском конгрессе по старению (Австрия, 2006; Санкт-Петербург, 2007); XII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007); Международном конгрессе «Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном обществе» (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «50 лет мелатонину: итоги и перспективы исследований» (Санкт-Петербург, 2008), Российских конференциях по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2007, 2008).
Связь с планом НИР
Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет».
Структура и объем диссертационной работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Объем работы составляет 373 страницы. Список литературы содержит 401 источник, в том числе 155 отечественных и 246 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 70 таблицами и 79 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Эксперименты были проведены на 1001 крысе, собственной разводки, первоначально полученных из НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова. Животных содержали в стандартных помещениях вивария площадью 25 м2 в клетках размером 44х25х62 см по 10 животных при температуре 22±20С. Все животные получали стандартный готовый лабораторный корм и воду без ограничений. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.
В работе были использованы мелатонин (N-acetyl-5-methoxy-tryptamine) (Sigma; США); эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), синтезированный в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН; физиологический раствор (Polfa; Польша).
На крысах изучали влияние различных световых режимов в сочетании с применением мелатонина и эпиталона на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и частоту спонтанных опухолей. Исследование проводили до естественной гибели животных. Для измерения освещенности помещений использовали люксметр "Ф-107" (Россия).
В 25-дневном возрасте всех крыс рандомизировано разделили на 4 группы. Первая группа крыс (159 самцов и 144 самки), находилась в условиях стандартного фиксированного режима освещения (12 часов свет 750 лк: 12 часов темнота; LD). Вторая группа животных (148 самцов и 144 самки) находилась в условиях естественного освещения (NL), в данном случае учитывались особенности годовой фотопериодичности Северо-Запада России. Многократные измерения освещенности производились в различное время суток в течение годового цикла. При данном режиме освещенность помещений определялась сезоном года: зимой минимальная продолжительность дня составляла 4,5 часа, а летом продолжительность светового дня достигала 24 часов («белые ночи»). Освещенность в помещении изменялась в течение суток и составляла на уровне клеток в утренние часы - 50-200 лк на 1 м2 площади, днем - до 1000 лк в ясный день и 500 лк в пасмурный день, к вечеру - от 150 до 500 лк на 1 м2 площади. Третья группа крыс (145 самцов и 149 самок) содержалась при круглосуточном постоянном освещении (750 лк; LL). Животные четвертой группы (51 самец и 61 самка) находились в условиях световой депривации (DD), при этом освещенность в помещении составляла 0-0,5 лк на 1 м2 площади.
В возрасте 4 месяцев крыс первых 3 групп разделили на 3 подгруппы. Крысы первой подгруппы получали 5 дней в неделю с питьевой водой в ночное время МЛТ (10 мг/л). Крысам второй подгруппы ежемесячно 5 дней в неделю подкожно в утренние часы вводили ЭПТ по 0,1 мкг на крысу в 0,1 мл физиологического раствора. Крысы третьей подгруппы являлись контрольными.
В работе исследовали различные показатели гомеостаза и старения (масса тела, поглощение корма и воды, диурез, эстральный цикл, поведенческие реакции, физическая работоспособность, процессы обучения и памяти). Проводили измерение уровня свободнорадикальных процессов, оценивали биохимические показатели жирового, углеводного, белкового и электролитного обменов, гормональный статус. Исследовали динамику гибели животных, продолжительность жизни и различные параметры канцерогенеза.
У крыс ежемесячно одновременно с взвешиванием производили определение количества потребляемого корма; проводили визуальный и пальпаторный осмотр на наличие опухолей и других заболеваний. У самцов регистрировали количество выпитой воды, диурез и содержание в моче глюкозы и кетонов (тест-полоски для анализа мочи «Multistix 10 SG»; «Байер», США), а также поведенческие, психоэмоциональные и когнитивные процессы. Для расчета функциональных периодов развития крыс-самцов были использованы методы, предложенные И.И. Шмальгаузеном (1935) и S. Brody (1945) [Махинько В.И., Никитин В.Н., 1977]. Поведенческие реакции изучали в тесте «открытое поле» [Буреш Я. и др., 1991]. Психоэмоциональные проявления оценивали по трехбалльной системе [Родина В. И. и др., 1993]. Тест «челночный лабиринт» использовали для оценки когнитивных процессов [Навакатикян М.А., Платонова Л.Л., 1988]. Для оценки статической работоспособности использовали тест «горизонтальный экран-сетка» [Анисимов В.Н. и др., 2001]. Для оценки динамической работоспособности использовали тест «принудительного плавания» [Бобков Ю.Г. и др., 1984]. У самцов и самок фиксировали время полового созревания (опущения яичек в мошонку и время открытия влагалища). Раз в три месяца у самок, начиная с 3-месячного возраста, брали влагалищные мазки для изучения эстральной функции. Пять особей из каждой исследуемой группы в возрасте 6, 12, 18 и 24 месяцев исследовали рентгенографически для определения возрастных изменений скелета.
В возрасте 3, 6, 12, 18 и 24 месяца у 10 крыс из каждой подгруппы собирали кровь, животных вскрывали и отбирали образцы тканей для последующего биохимического и морфологического исследования. Стандартными биохимическими методами определяли уровень глюкозы, общего белка, холестерина, в-липопротеидов, мочевины, креатинина, ионов натрия и калия в крови [Комаров Ф.И. и др., 1976]. Содержание трийодтиронина, тироксина, тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови определяли в автоматическом анализаторе IMMULITE (США) с помощью твердофазных, хемилюминесцентных ферментных иммунных наборов IMMULITE; при помощи иммуноферментного метода (наборы фирмы «Биохиммак», США) - содержание пролактина и С-пептида. Оценивали суммарную динамику изучаемых параметров по коэффициенту стабильности гомеостаза (КСГ), который представлял собой отношение общего числа биохимических и эндокринологических показателей, соответствующих значениям у зрелых крыс в возрасте 3 мес., к общему числу изучаемых показателей [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1991].
Оценивали параметры, характеризующие уровень образования свободных радикалов и системы антиоксидантной защиты в печени, почках, сердце, скелетной мышце: уровень хемилюминесценции, активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Состояние антиоксидантной системы (АОС) определяли хемилюминесцентным методом с использованием двух люминофоров: люминола и люцегинина и двух активаторов свечения: соли железа двухвалентного и перекиси водорода. Активность СОД исследовали модифицированным адренохромным методом Fridovich, активность каталазы по количеству разложенной перекиси водорода - спектрофотометрическим методом по Beers, Sizes; содержание белка определяли методом Lowry.
Убитых или павших по ходу опыта животных вскрывали. На аутопсии осматривали все внутренние органы. Новообразования классифицировали согласно рекомендациям МАИР как «фатальные» или как «случайные» [Gart J.J. et al., 1986]. Все опухоли и основные внутренние органы, подозрительные на наличие опухолевого роста, после обычной гистологической обработки изучали микроскопически. Использовали гистологическую классификацию опухолей, предложенную МАИР [Turusov V.S., Mohr U., 1990].
Рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ) всех и последних 10% максимально проживших крыс, максимальную продолжительность жизни (МПЖ). При анализе скорости старения параметры модели Гомперца определяли по реальным данным, используя метод максимального правдоподобия в приложении для Гауссовских статистических систем [Gauss System and Graphic Manual, 1994]. При расчете кинетических параметров популяционного старения использовали модель Гомперца для функции выживания:
,
где параметры б и в связаны с популяционной скоростью старения и начальной силой смертности, соответственно.
Параметр б часто характеризуется также величиной времени удвоения силы смертности (MRDT), рассчитанный как ln(2)/б. Для анализа выживания использовали метод Кокса. Доверительные интервалы для показателей скорости старения рассчитывали, используя log-подобные функции [Cox D.R., Oakes D., 1996].
Анализ данных проводился в среде интегрированных пакетов статистических программ STATGRAPH, STADIA, EXCEL общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность результатов оценивали по t-критерию Стьюдента, непараметрическому U-критерию Уилксона-Манна-Уитни, точным методом Фишера и методом ч2, а также P-value, рекомендованного МАИР. Для оценки влияния различных факторов (режим освещенности, препарат, пол животных) на изучаемые показатели использовали многофакторный дисперсионный анализ и рассчитывали уравнение регрессии [Ивантер Э.В., Коросов А.В., 2003].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и возрастную патологию
Одной из задач исследования явилось изучение влияния различных режимов освещения на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез. Последовательный анализ изучаемых параметров показал, что скорость старения крыс в различных режимах неодинакова (табл. 1). Изменение большинства показателей указывает на неблагоприятное влияние LL и NL режима. Данные таблицы 1 являются суммарным результатом эффекта нарушения фотопериодизма, когда возраст подопытных животных равнялся 24 месяцам. За животными наблюдали до времени гибели последней крысы.
Таким образом, у крыс, находящихся в условиях LL, отмечалось снижение прироста массы тела, повышение потребления корма, увеличение времени полового созревания; чаще встречались такие заболевания, как пневмония, кератит, конъюнктивит, катаракта, инфекции ЖКТ и мочевыделительной системы, ринит, отит и миокардит; наблюдалось повышение уровня пролактина, тироксина, С-пептида, глюкозы, холестерина, бета-липопротеидов, мочевины и креатинина с одновременным снижением уровня ТТГ, общего белка и калия в крови; снижение КСГ. В печени этих животных наблюдалось снижение содержания каталазы, СОД, белка; в почках - снижение содержания каталазы, СОД, общей активности АОС; в сердце - снижение содержания белка; в скелетной мышце - снижение общей АОС, каталазы, СОД и белка; увеличение спонтанного канцерогенеза.
Для самок крыс, находящихся в режиме LL, было характерно снижение массы тела, более быстрое старение эстральной функции, снижение СПЖ и МПЖ. У самцов наблюдались уменьшение фазы прогрессивного и стабильного роста; увеличение продолжительности предстарческого периода; более ранее наступление старческого периода, более ранее появление глюкозы, кетонов в моче; выраженная глюкозурия; снижение диуреза; повышение двигательной активности и психоэмоциональных проявлений; снижение когнитивных функций и физической работоспособности. Самцы и самки уже в возрасте 3 месяцев весили больше, чем крысы в LD режиме. Относительное количество особей, имеющих абдоминальное ожирение, было больше в этой группе по сравнению с другими (табл. 2).
Имеются данные о положительной корреляции между повышенной массой тела и развитием новообразований [Weindruch R., Walford R., 1988; Dilman V.M., 1994], наши результаты находятся в определенном соответствии с этими наблюдениями. Расчет силы влияния возраста животных, различных режимов освещения, сезона года на массу тела крыс методом многофакторного дисперсионного анализа выявил зависимость динамики массы тела самцов от возраста (48,17%; F=62,88; р<0,05) и сезона года (9,68%; F=16,9; р<0,05).