12
Антиапоптозный механизм реализации гепатопротекторного эффекта производных пиримидина в исследованиях in vivo
А.А. Парфенов, А.Б. Выштакалюк, И.В. Галяметдинова,
В.Э. Семёнов, В.В. Зобов
Аннотация
В работе исследовано влияние производных пиримидина (лекарственного препарата Ксимедон и его конъюгата с Z-аскорбиновой кислотой, проявляющих гепатопро- текторную активность) на апоптоз клеток печени крыс на фоне воздействия гепатотокси- ческого агента тетрахлорметана. Предпринята попытка определить, на какие маркеры апоптоза воздействуют исследуемые соединения - Ксимедон и его конъюгат с Z-аскорбиновой кислотой. Основным использованным методом был современный мультиплексный анализ маркеров раннего апоптоза Akt, BAD, BCL-2, p53, Active Caspase-8 Active и Caspase- 9 в гомогенатах печени крыс с применением системы MagPix (MerkMillipore, США). В результате исследования выявлено, что Ксимедон и его производное с Z-аскорбиновой кислотой проявляют антиапоптозный эффект, приводя к существенному снижению количества маркеров раннего апоптоза BAD, Active Caspase-9, а также что производное с Z-аскорбиновой кислотой уменьшает экспрессию p53. Более того, было показано, что под действием соединений происходит нормализация исследованных биохимических маркеров повреждения печени (трансаминаз, щелочной фосфатазы, билирубина, общего белка, альбумина) и повышение уровня глюкозы в сыворотке крови крыс на фоне острого токсического повреждения печени четыреххлористым углеродом. Полученные результаты имеют как теоретическую ценность - раскрывают механизмы действия производных пиримидина, так и практическую, связанную с возможностью создания эффективного препарата с гепатопротекторной активностью.
Ключевые слова: производные пиримидина, Ксимедон, апоптоз, четыреххлористый углерод, токсическое повреждение печени
Введение
Печень в организме играет ключевую роль в детоксикации экзогенных и эндогенных токсичных веществ. Несвоевременно начатое лечение легких форм патологий печени, вызванных действием гепатотоксических веществ, может привести к более серьезным, вплоть до некротических повреждений [1]. Объектом настоящего исследования были лекарственный препарат на основе производного пиримидина Ксимедон (соединение 1) и его конъюгат с Z-аскорбиновой кислотой (соединение 2). Структурная формула этих соединений представлена на рис. 1.
Рис. 1. Структурная формула исследуемых соединений: 1 - Ксимедон; 2 - конъюгат Ксимедона с Z-аскорбиновой кислотой
Ксимедон (1,2-дигидро-4,6-диметил-1 -(2-гидроксиэтил)-пиримидин-2-он) - оригинальное российское лекарственное соединение, стимулятор регенерации тканей. Химическое соединение было синтезировано в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова в 1966 г. Оно обладает широким спектром действия, включая мембраностабилизирующее, регенерирующее, иммуномодулирующее и т. д. [2].
Ранее были получены данные, которые показали, что конъюгирование Ксиме- дона с некоторыми биологически активными кислотами приводит к усилению протекторного действия самой молекулы Ксимедона [3-9].
В результате поисковых исследований было выяснено, что конъюгат Ксимедона с Z-аскорбиновой кислотой в отличие от прочих исследованных конъюгатов обладает более выраженным и стабильным гепатопротекторным эффектом. In vivo было показано, что соединение 2 способствует уменьшению проявления морфологических признаков повреждения печени, индуцированных четыреххлористым углеродом [10]. Было также выявлено, что соединение 2 способствует нормализации биохимических маркеров повреждения тканей печени в крови животных на фоне воздействия четыреххлористого углерода [10]. Более того, для конъюгата Ксимедона с Z-аскорбиновой кислотой показан более выраженный гепатопротекторный эффект, чем для препарата сравнения - Тиотриазолина [10].
Таким образом, с учетом того факта, что нам известен гепатопротекторный потенциал конъюгата Ксимедона с Z-аскорбиновой кислотой, в настоящей работе предпринята попытка установить механизм, по которому осуществляется протекторный эффект изучаемого конъюгата. Цель настоящего исследования - изучить влияние лекарственного препарата Ксимедон и его конъюгата с Z-аскорбиновой кислотой, проявляющих гепатопротекторную активность, на апоптоз клеток печени крыс на фоне воздействия гепатотоксического агента тетрахлорметана.
Материалы и методы
Синтез исследуемых соединений. Ксимедон (1,2-дигидро-4,6-диметил-1- (2-гидроксиэтил)-пиримидин-2-он) и его конъюгат с Z-аскорбиновой кислотой были синтезированы по ранее описанным в [4, 11] методам из 2-дигидро-4,6- диметилпиримидин-2-она и 2-хлорэтанола.
Дизайн эксперимента на лабораторных животных. Эксперименты проводили на взрослых самцах крыс линии Wistar массой тела 300-350 г, полученных из НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН» (г. Пущино).
Животных содержали в соответствии с положениями руководства доклинических испытаний [12] и руководства Европейского комитета по содержанию и уходу за животными, используемыми для экспериментов и других исследовательских целей (Commission recommendation of 18 June 2007 on guidelines for the accommodation and care of animais used for experimental and other scientific purposes, 2007/526/EC), в стандартных условиях вивария с 12-часовым световым днем и неограниченным доступом к еде и воде. Животных кормили комплексным кормом, изготовленным по ТУ 9296-002-70941247-2005 (белок 22%, клетчатка не более 4%, жир не более 5%, зола не более 9%, влажность не более 13.5%, калорийность 295 ккал на 100 г). Все исследования и протоколы по работе с животными были одобрены локальным этическим комитетом Казанского (Приволжского) федерального университета (протокол № 4 от 18 мая 2017 г.).
Всего в эксперименте участвовало 24 животных (по 6 в каждой из 4 экспериментальных групп). Схема эксперимента выглядела следующим образом: введение CCl4 в течение 3 дней, затем введение препаратов в течение 6 дней (всего 9 дней). Забор материала (кровь для биохимических исследований, образцы печени) осуществляли на следующий день после последнего введения CCl4 (4-й день с начала эксперимента), спустя 3 дня после прекращения введения CCl4 и 3 дня введения препаратов (7-й день эксперимента) и спустя 6 дней после прекращения введения CCl4 и 6 дней введения препаратов (10-й день эксперимента), при эвтаназии животных.
Четыреххлористый углерод вводили перорально в виде 35% -ного масляного раствора, в дозе 1.5 мг/кг. Исследуемые соединения 1 и 2 вводили внутри- брюшинно в дозах 0.24 и 0.5 мг/кг. Растворы препаратов готовились каждый день непосредственно перед введением животным.
Сыворотку крови готовили путем двукратного центрифугирования крови при 3000 об./мин и температуре +4 °C. Хранение сыворотки до анализа осуществляли в морозильной камере при температуре -25 °C. Биохимические показатели исследованы на автоматическом биохимическом анализаторе АРД 200 («АРД», Россия) с помощью набора реагентов для клинической биохимии (Chronolab, Швейцария).
Гистологические исследования. Гистологическую проводку, приготовление парафиновых срезов, окрашивание гематоксилином Гарриса (BioVitrnm, Россия), спиртовым эозином (BioVitrnm, Россия) осуществляли по стандартным протоколам, более подробно описанным в работах [4-9]. Приготовление замороженных срезов и окрашивание их суданом 4 (BioVitrnm, Россия) также выполняли по стандартным протоколам.
Исследование молекулярных маркеров апоптоза. Маркеры были изучены в лизатах печени крыс согласно протоколу к набору Early Apoptosis Magnetic Bead Kit (MilliporeSigma, США) с измерением показателей на приборе MagPix (MerkMillipore, США).
Для исследования маркеров апоптоза предварительно проводили лизирова- ние 50 мг образцов ткани печени, отобранных у животных во время эвтаназии, согласно инструкциям к набору “MicroRotofor Lysis Kit” (“BioRad”, США), с добавлением ингибиторов протеаз “Protease Inhibitor Cocktail” (“Sigma-Aldrich”, США). Далее выполняли выравнивание всех образцов по концентрации общего белка до 100 мкг/мл посредством измерения концентрации белка в образцах методом Брэдфорда с использованием набора Quick Start Bradford Protein Assay Kit (BioRad, США) и микропланшетного спектрофотометра Epoch (BioTech, США). Для построения калибровочного графика использовали бычий сывороточный альбумин (Amresco, США).
Статистическая обработка. Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны. На рисунках представлены средние значения для каждого стандартного параметра и стандартные ошибки. В случае нормального распределения проводили дисперсионный анализ ANNOVA (при равенстве дисперсий) либо тест Уэлча (при неравенстве дисперсий). При выявлении различий между группами проводили их сравнение с помощью апостериорных тестов Тьюки HSD (при равенстве дисперсий) и теста Гэймса - Хоуэлла (при неравенстве дисперсий). Равенство дисперсий проверяли с помощью теста Левена. В случае отклонения распределения от нормального проводили тест Краскала - Уоллиса. При выявлении различий между группами использовали тест Манна - Уитни с поправкой на множественные сравнения. Новый уровень критической значимости рассчитывали по формулам [13]
p* = 1 - 0.9517 n,
n = 0.5N(N -1),
где p* - новый уровень значимости, n - количество производимых сравнений, N - количество изучаемых групп.
В случае нахождения отличий на рисунках показаны вычисленные уровни значимости р для использованного в данном случае теста.
Статистическая обработка выполнена в программе SPSS 22.0. Визуализация данных осуществлена с помощью Origin Lab 2018, обработка рисунков выполнена в Adobe Photoshop 18.00.
Результаты
Оценка клинического состояния животных. После трехдневного курса введения СС14 у животных наблюдается картина острого токсического повреждения печени, подтвержденная на гистологических срезах, где были заметны очаги стеатоза, дистрофии гепатоцитов и некротических изменений (рис. 2).
Рис. 2. Микрофотографии срезов печени крыс после трехдневного воздействия СС14: а - окраска гематоксилином и эозином (1 - гидропическая дистрофия, 2 - тельце Каунсильмена, 3 - крупнокапельная жировая дистрофия, 4 - балонная дистрофия, 5 - мелкокапельная жировая дистрофия); б - окраска суданом 4 (оранжевый цвет - капли жира)
На фоне введения соединений 1 и 2 изменения активности аминотрансфераз не носят такого выраженного характера, как это было в контрольной группе. Так, активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) при введении соединений 1 и 2 на 7-й и 10-й день снизилась менее значительно относительно показателей интактных животных, достоверных отличий от интактной группы обнаружено не было, в отличие от контрольной группы, где наблюдалось достоверное снижение АлАТ по сравнению с интактной группой на 4-й (р = 0.000, тест Тьюки HDS), 7-й (р = 0.028, тест Тьюки HDS) и 10-й день (р = 0.000, тест Тьюки HDS). Однако статистически достоверных различий между контрольной и опытными группами в соответствующие дни исследований не наблюдалось (рис. 3. б). Активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) на фоне введения соединений 1 и 2 практически не отличалась от референсных значений интактной группы животных. На фоне применения соединения 1 и 2 на 10-й день эксперимента активность АсАТ была статистически достоверно выше по сравнению с контрольной группой (р = 0.003 и р = 0.038, тест Геймса - Хоуэлла), в которой было выявлено достоверное снижение данного показателя (р = 0.000, тест Геймса - Хоуэлла) (рис. 3, а).
Рис. 3. Влияние соединений 1 и 2 на маркеры цитолиза клеток: а) активность аспартатами- нотрансферазы (АсАТ); б) активность аланинаминотрансферазы (АлАТ). 1 - отличия от интактной группы; 2 - отличия от контрольной группы того же дня. Уровни значимости р определены в тестах Тьюки ИБ8 и Геймса - Хоуэлла
Под действием CCl4 в контрольной группе в динамике наблюдения выявлено снижение активности щелочной фосфатазы (ЩФ), концентраций билирубина общего и его фракций (конъюгированного и неконъюгированного билирубина) на 7-й и 10-й день опыта (рис. 4). В опытных группах на 10-й день по сравнению с интактной группой уровни ЩФ, билирубина общего и его фракций не претерпевали значительных изменений.
При использовании соединений 1 и 2 по сравнению с контрольной группой отмечено достоверное повышение концентрации общего билирубина на 10-й день эксперимента (р = 0.000 и р = 0.000, тест Геймса - Хоуэлла) (рис. 4, б).
Рис. 4. Влияние соединений 1 и 2 на маркеры желчевыведения и выведения билирубина: а) активность щелочной фосфатазы (ЩФ); б) концентрация общего билирубина; в) концентрация неконъюгированного билирубина; г) концентрация конъюгированного билирубина. 1 - отличия от интактной группы; 2 - отличия от контрольной группы того же дня; 3 - отличия контрольных показателей на 4-й день от контрольных показателей на 10-й день. Уровни значимости р определены в тестах Тьюки ИБ8 и Геймса - Хоуэлла
ксимедон печень токсический пиримидин
При использовании соединений 1 и 2 на фоне токсических CCI ^индуцированных повреждений наблюдалось менее выраженное по сравнению с контрольной группой снижение концентрации общего белка и альбумина. На 10-й день опыта при использовании соединений 1 и 2 было отмечено статистически достоверное повышение количества общего белка (р = 0.045 и р = 0.049, тест Тьюки HDS) и альбумина (р = 0.000 и р = 0.000, тест Геймса - Хоуэлла) по сравнению с контрольной группой (рис. 5, а, б).
На фоне воздействия СС14 в контрольной группе к 10-му дню эксперимента наблюдается снижение концентрации глюкозы (р = 0.037, тест Геймса - Хоуэлла). При использовании соединений 1 и 2 подобного снижения не зафиксировано: концентрация глюкозы остается достоверно выше контроля (р = 0.025 и р = 0.005, тест Геймса - Хоуэлла) (рис. 5, в).
Рис. 5. Влияние соединений 1 и 2 на маркеры белкового обмена и глюкозу: а) концентрация альбумина; б) концентрация общего белка; в) концентрация глюкозы. 1 - отличия от интактной группы; 2 - отличия от контрольной группы того же дня. Уровни значимости р определены в тестах Тьюки ИБ8 и Геймса - Хоуэлла