Молекулярные маркеры раннего апоптоза. Изучение маркеров раннего апоптоза лизатов печени позволило нам увидеть, каким образом трехдневное введение CCl4 способствует возникновению такой тенденции, как увеличение MFI (Mean intensity of fluorescence - средняя интенсивность флуоресценции) проапоптотического белка BAD семейства BCL на 7-й и 10-й день эксперимента по сравнению с интактной группой (р = 0.011 и р = 0.021, тест Манна - Уитни) (рис. 6, а).
В свою очередь, введение соединений 1 и 2 способствовало снижению MFI данного маркера раннего апоптоза. Так, соединение 1 на 7 -й день эксперимента не оказало на обозначенный маркер значительного эффекта (рис. 6, а). Только на 10-й день эксперимента происходит снижение MFI BAD-белка в группе животных, которых лечили соединением 1 по сравнению с его содержанием в интактной группе животных (р = 0.000, тест Манна - Уитни) , а также с аналогичными показателями в контрольной группе (р = 0.000, тест Манна - Уитни) (рис. 6, а). При использовании соединения 2 снижение MFI BAD-белка по отношению к контролю отмечено как на 7-й день эксперимента (р = 0.005, тест Манна - Уитни), так и на 10-й (р = 0.003, тест Манна - Уитни) (рис. 6, а). Рассматривая антиапоптотические маркеры BCL-2 и Akt в настоящем исследовании, мы не можем говорить о каком-либо достоверном влиянии на них CCl4 и соединений 1 и 2, хотя очевидна тенденция к их повышению под влиянием CCl4 в контрольной группе и к снижению в опытных группах, особенно на 10-й день опыта (рис. 6, б, в).
Рис. 6. Влияние соединений 1 и 2 на среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) маркеров раннего апоптоза: а) MFI BAD; б) MFI BCL-2; в) MFI Akt. 1 - отличия от интактной группы; 2 - отличия от контрольной группы того же дня. Уровни значимости p определены в тесте Манна - Уитни; критический уровень значимости р = 0.002
Трехдневное введение CCl4 приводило к постепенному увеличению MFI активированной каспазы 9 (CASP9) на 10-й день эксперимента (р = 0.006, тест Манна - Уитни) (рис. 7, а).
Введение соединения 1 способствовало достоверному уменьшению активации CASP9 на 10-й день эксперимента (р = 0.000, тест Манна - Уитни), а введение соединения 2 - как на 7-й, так и на 10-й день по сравнению с контрольной группой животных (р = 0.004 и р = 0.006, тест Манна -Уитни) (рис. 7, а).
С другой стороны, введение CCl4 и препаратов не привело к существенному изменению MFI активированной каспазы 8 (CASP8) (рис. 7, б).
Рис. 7. Влияние соединений 1 и 2 на среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) активированных каспаз 9 и 8: а) MFI активированной каспазы 9 (CASP9); б) MFI активированной каспазы 8 (CASP8). 1 - отличия от интактной группы, 2 - отличия от контрольной группы того же дня. Уровни значимости p определены в тесте Манна - Уитни; критический уровень значимости р = 0.002
Отмечена также тенденция к снижению MFI белка р53 при использовании соединения 2 относительно контроля на 7-й день исследования (рис. 8).
Рис. 8. Влияние соединений 1 и 2 на среднюю интенсивность флуоресценции MFI р53. 2 - отличия от контрольной группы того же дня. Уровни значимости р определены в тесте Манна - Уитни; критический уровень значимости р = 0.002
Обсуждение
Механизм действия самой молекулы Ксимедона предположительно связан с регуляцией активности аденилатциклазы (АЦ), так как имеются данные о том, что Ксимедон снижает активность данной сигнальной молекулы в иммунокомпетентных клетках [14]. Если говорить о дальнейших последствиях активации или ингибирования АЦ, то стоит упомянуть, что существуют разные изоформы АЦ, регуляция которых опосредована G-белками [15]. Сама регуляция активности АЦ через субъединицы G-белка топоспецифична, то есть зависит от изоформы АЦ и типа клетки [15]. Активность АЦ связана с продуцированием в клетке циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) [16], который, в свою очередь, активирует в ней регуляторные процессы в зависимости от ее типа [17]. Например, имеются данные о том, что высокие концентрации цАМФ стимулируют пролиферацию эпителиальных клеток, гепатоцитов, адипоцитов и в-клеток поджелудочной железы [18].
Но в то же время высокая продукция цАМФ клетками фибробластов, гладкомышечных, неопластических В-клеток, наоборот, подавляет пролиферацию этих клеток [18].
После трехдневного курса введения CCl4 у животных наблюдается картина острого токсического повреждения печени, выраженного в изменении активности ферментов АсАТ и АлАТ. Резкое повышение АсАТ после курса введения токсиканта может объясняться тем, что АсАТ, как и АлАТ, в клетках печени содержится в больших количествах [19]. Наибольшая его активность наблюдается в митохондриях периферической зоны ацинуса [20]. Следовательно, остротоксическое повреждение клеток этой зоны будет вызывать более резкое повышение активности именно сывороточной АсАТ, нежели АлАТ [21].
Увеличение некротических повреждений на 4-й день опыта привело к возникновению нарушений выведения билирубина из крови, что может являться признаком желтухи [22, 23].
Резкое снижение (значительно ниже референсных значений) в контрольной группе трансаминаз АсАТ и АлАТ, а также ЩФ, общего билирубина и его фракций на 7-й и 10-й день опыта связано с уменьшением функциональной активности гепатоцитов в результате токсического повреждения и/или с уменьшением количества функционирующих гепатоцитов.
Установлено [21], что период полувыведения общего АсАТ из кровотока составляет около 17 ч и митохондриального - 87 ч. Применение соединений Ксимедона и его конъюгата с L- аскорбиновой кислотой привело к менее выраженным изменениям исследованных показателей, что свидетельствует о меньших некротических и других патологических повреждениях паренхимы печени, а также о повышении функциональной активности гепатоцитов.
Отмеченное в нашем эксперименте снижение концентраций общего белка и альбумина на фоне воздействия токсиканта вполне логично, так как при повреждениях паренхимы печени происходит снижение ее синтетической функции [24, 25]. Как следует из полученных нами данных, при использовании Ксимедона и его конъюгата с L-аскорбиновой кислотой наблюдается сохранение синтетической функции печении либо интенсификация таковых процессов у неповрежденных гепатоцитов.
Получены также данные, свидетельствующие о нормализации концентрации глюкозы в крови под воздействием Ксимедона и его конъюгата с аскорбиновой кислотой на фоне повреждений, вызванных CCl4.
В ходе исследования маркеров раннего апоптоза нами выявлено, что Кси- медон (на 10-й день эксперимента) и его конъюгат с L-аскорбиновой кислотой (на 7-й и 10-й день эксперимента) способствуют снижению MFI проапоптотического белка BAD.
Этот белок, содержащий только BH3, ингибирует антиапопто- тические BCL-2 и BCL-xL и способствует активации BAX/BAK в ответ на апопто- тические стимулы [26].
Это является свидетельством того, что данные соединения снижают инициацию апоптотических процессов в клетках, тем самым не только компенсируя воздействие CCl4, но и приводя к снижению экспрессии проапоптотического белка BAD ниже значений интактной группы животных.
Однако в данном случае уменьшение MFI проапоптотического белка BAD не связано с MFI Akt, которая считается ингибитором апоптоза из-за ее способности инактивировать проапоптотические молекулы, включая каспазу-9 (CASP9) и белок BAD [27, 28].
Таким образом, снижение MFI BAD под воздействием Ксимедона и его конъюгата с L-аскорбиновой кислотой, скорее всего, связано не с его фосфорилированием Akt, а с уменьшением экспрессии в клетке этого белка. Нами также не выявлено достоверного увеличения MFI антиапоптотического белка BCL-2.
Этот белок предотвращает апоптоз либо путем секвестирования проформ каспаз, вызывающих гибель клетки, либо путем предотвращения высвобождения митохондриальных апоптогенных факторов, таких как цитохром C и AIF (фактор, вызывающий апоптоз), в цитоплазму [29].
В проведенном эксперименте CCl4 способствовал активации преимущественно внутреннего пути апоптоза клеток печени, связанного с активацией CASP9 [30].
Отмеченное снижение интенсивности флюоресценции как белка BAD, так и активированной каспазы-9 при введении Ксимедона на 10-й день эксперимента и конъюгата Ксимедона с Z-аскорбиновой кислотой на 7-й и 10-й день эксперимента может быть свидетельством меньших повреждений митохондриальных мембран и меньшего выхода цитохрома C, запускающего активацию апоптоти- ческих процессов [31].
Подобный антиапоптозный механизм действия молекулы Ксимедона предположительно может быть связан с регуляцией АЦ [14] и увеличением продукции цАМФ в гепатоцитах. Так, в имеющихся литературных данных представлены свидетельства того, что цАМФ в гепатоцитах является антиапоптотической молекулой [32].
Усиление антиапоптозных свойств конъюгата Ксимедона с Z-аскорбиновой кислотой, проявляющееся в том, что эффект снижения маркеров апоптоза наступает быстрее, во-первых, обусловлено высокой биодоступностью Z-аскорбиновой кислоты для клеток, приводящей, вероятно, к повышению биодоступности и конъюгированной молекулы Ксимедона.
Имеются исследования, показывающие, что поступление витамина С в организм опосредовано классом №+-зависимых транспортеров, называемых SVCT (SVCT1 - в клетках кишечника, SVCT2 - в клетках других органов), а транспорт аскорбиновой кислоты - семейством GLUT переносчиков глюкозы [33].
Соответственно, конъюгация с витамином С является возможным инструментом для улучшения биодоступности и усвоения лекарств [34, 35]. Во-вторых, существуют данные о том, что Z-аскорбиновая кислота может действовать синергично с другими веществами.
Например, аскорбиновая кислота совместно с фенилэфрином и метапротеренолом может усиливать синтез и пролиферацию ДНК первичной культуры гепатоцитов [36], тогда как сами фенилэфрин и метапротеренол не ускоряют синтез и пролиферацию ДНК первичной культуры гепатоцитов [39]. Кроме того, показано, что Z-аскорбиновая кислота сама по себе способна ускорять регенерацию ткани печени крыс [37].
Заключение
Показано, что Ксимедон и его конъюгат с Z-аскорбиновой кислотой на фоне повреждений, вызванных трехдневным введением CCl4, способствуют сохранению функций и повышению активности клеток печени, что проявляется в нормализации исследованных биохимических показателей: трансаминаз, щелочной фосфатазы, билирубина, белка, альбумина, в повышении уровня глюкозы.
Кроме того, Ксимедон и его конъюгат с Z-аскорбиновой кислотой в условиях токсического повреждения печени CCl4 проявляют антиапоптозный механизм действия, приводя к достоверному снижению в ткани печени крыс экспрессии проапоптотических маркеров BAD и CASP9.
Для конъюгата Ксимедона с Z-аскорбиновой кислотой выявлено более быстрое проявление антиапоптозного эффекта по сравнению с Ксимедоном и воздействие на большее число маркеров раннего апоптоза (включая CASP9, BAD, p53), что указывает на более высокую эффективность конъюгата.
Литература
1. Arias I.M., Alter H.J., Boyer J.L., Cohen D.E., Shafritz D.A. The Liver: Biology and Pathobiology. - Oxford: John Wiley & Sons, 2020. - 1144 p.
2. Измайлов С.Г., Паршиков В.В. Измайлов С.Г., Паршиков В.В. Ксимедон: настоящее и будущее // Нижегород. мед. журнал. - 2002. - № 3. - С. 81-87.
3. Porfiriev A., Sharafutdinova D., Belyaev A., Parfenov A., Shubina V., Golubev A., Vyshtakali- ukA., Zobov V., Semenov V. The influence of the Xymedon conjugate with L-methionine on the regeneration of Schmidtea mediterranea planarians // BioNanoScience. - 2020. - V. 10, No 2. - P. 397-402. - doi: 10.1007/s12668-020-00735-z.
4. Vyshtakalyuk A.B., Semenov V.E., Zobov V.V., Galyametdinova I.V., Gumarova L.F., Parfenov A.A., Nazarov N.G., Lenina O.A., Kondrashova S.A., Latypov Sh.K., Cherepnev G.V., Shahyn M.S., Reznic V.S. Synthesis and primary evaluation of the hepatoprotective properties of novel pyrimidine derivatives // Russ. J. Bioorg. Chem. - 2017. - V. 43, No 5. - P. 604611. - doi: 10.1134/S106816201704015X.
5. Vyshtakalyuk A., Parfenov A., Gumarova L., Nazarov N., Zobov V., Galyametdinova I., Semenov V. Comparative evaluation of hepatoprotective activity of Xymedon preparation derivatives with ascorbic acid and methionine // BioNanoScience. - 2017. - V. 7, No 4. - P. 616-622. - doi: 10.1007/s12668-017-0461-8.
6. Vyshtakalyuk A.B., Parfenov A.A., Gumarova L.F., Khasanshina L.R., Belyaev G.P., Nazarov N.G., Kondrashina D.A., Galyametdinova I.V., Semenov V.E., Zobov V.V. Conjugate of pyrimidine derivative, the drug xymedon with succinic acid protects liver cells // J. Biochem. Mol. Toxicol. - 2020. - V. 35, No 3. - Art. e22660, P. 1-12. - doi: 10.1002/jbt.22660.
7. VyshtakalyukA.B., Parfenov A.A., Nazarov N.G., Gumarova L.F., Cherepnev G.V., Galyametdinova I.V., Zobov V.V., Semenov V.E. Hepato-, nephro-and pancreatoprotective effect of derivatives of drug Xymedon with biogenic acids under toxic influence of carbon tetrachloride in rats // BioNanoScience. - 2018. - V. 8, No 3. - P. 845-858. - doi: 10.1007/s12668-018-0526-3.
8. Vyshtakalyuk A.B., Semenov V.E., Sudakov I.A., Bushmeleva K.N., Gumarova L.F., Parfenov A.A., Nazarov N.G., Galyametdinova I.V., Zobov V.V. Xymedon conjugate with biogenic acids. Antioxidant properties of a conjugate of Xymedon with L-ascorbic acid // Russ. Chem. Bull. - 2018. - V. 67, No 4. - P. 705-711. - doi: 10.1007/s11172-018-2126-3.
9. Parfenov A.A., Vyshtakalyuk A.B., Gumarova L.F., Khasanshina L.R., Belyaev G.P., Nazarov N.G., Kondrashina D.A., Galyametdinova I.V., Zobov V.V., Semenov V.E. Xymedone conjugate with para-aminobenzoic acid. Estimation of hepatoprotective properties // Russ. Chem. Bull. - 2019. - V. 68, No 12. - P. 2307-2315. - doi: 10.1007/s11172-019-2704-z.
10. Vyshtakalyuk A.B., Nazarov N.G., Semenov V.E., Galyametdinova I.V., Diabankana R.G.K., Porfiriev A.G., Zobov V. V. Recovery of liver damaged by CCl4 under treatment by conjugate of drug Xymedon with L-ascorbic acid // Int. J. Pharm. Sci. Res. - 2018. - V. 9, No 10. - P. 4117-4126. - doi: 10.13040/IJPSR.0975-8232.9(10).4117-26.
11. Reznik V.S., Pashkurov N.G. Reactions of pyrimidinols and pyrimidinethiols with 2-chlo- roethanol and with 2-chloro-1-propanol // Bull. Acad. Sci. USSR, Div. Chem. Sci. - 1966. - V. 15, No 9. - P. 1554-1557. - doi: 10.1007/BF00848915.