15. Активный центр фермента и его свойства.

Ответ. В процессе формирования фермент-субстратного комплекса субстрат присоединяется к специфическому участку на молекуле фермента, который называется активным центром. Активный центр – участок молекулы фермента, который связывает субстраты и от которого зависит специфичность каталитического действия ферментов; активный центр содержит функциональные группы остатков аминокислот и коферментов, пространственно сближенных и определённым образом ориентированных. Несмотря на огромное разнообразие структуры ферментов, их специфичности и механизма действия, существует ряд общих закономерностей формирования активных центров. Во-первых, на активный центр приходится относительно малая часть объёма фермента. Роль остальных аминокислотных остатков, составляющих основную массу фермента, состоит в том, чтобы обеспечить молекуле фермента правильную глобулярную форму. Во-вторых, активный центр – это сложная трёхмерная структура, и в её образовании принимают участие группы, принадлежащие разным частям линейной последовательности аминокислот. Радикалы аминокислот, образующих активный центр, оказываются вблизи друг от друга в результате формирования третичной структуры белка. Поэтому при воздействии факторов, вызывающих денатурацию (нагревание, концентрированные кислоты и щёлочи) утрачивается конформация активного центра и фермент теряет свою активность. В-третьих, активный центр имеет форму узкого углубления или щели, в которую ограничен доступ воде, за исключением тех случаев, когда вода является одним из реагирующих веществ. В этом углублении присутствует несколько полярных аминокислотных остатков, необходимых для связывания субстрата и катализа. В-четвёртых, в составе активного центра можно условно выделить две части: а) контактный или якорный участок, где происходит связывание субстрата в нужной ориентации; б) каталитический участок, обеспечивающий протекание реакции. В-пятых, субстраты относительно слабо связываются с ферментами. В связывании и превращении субстрата принимают участие следующие группировки аминокислотных радикалов: полярные заряженные: карбоксильные группы глутамата и аспартата, аминогруппы лизина; гуанидиновые группы аргинина; имидазольные группы гистидина; полярные незаряженные: гидроксильные группы серина и треонина; сульфгидрильные группы цистеина; фенольные группы тирозина; неполярные группы: углеводородные цепи алифатических аминокислот; ароматические кольца фенилаланина и триптофана. У сложных ферментов в формировании активных центров принимают участие также функциональные группы коферментов. В образовании фермент-субстратных комплексов принимают участие те же молекулярные взаимодействия, что и обеспечивают формирование пространственной структуры макромолекул, межклеточные контакты и другие процессы в биологических системах: водородные связи между полярными незаряженными группировками субстрата и фермента; ионные связи между противоположно заряженными группировками субстрата и фермента; гидрофобные взаимодействия между неполярными группировками субстрата и фермента. Эти три основных типа нековалентных связей различаются по своей геометрии, энергии, специфичности. Коферменты относятся к сложным органическим веществам, их молекулы значительно меньше по размеру, чем молекулы ферментов. Коферменты могут проникать через биологические мембраны, нагревание обычно не вызывает изменения их структуры. Функцией кофермента является участие в катализируемой реакции, причём количество фермента и его химическое строение внешне остаются неизменными. В действительности кофермент является одним из субстратов ферментативной реакции, т.е. выступает как косубстрат. В ходе реакции кофермент претерпевает химические превращения, в точности противоположные тем, которые происходят в субстрате. Например, в окислительно-восстановительных реакциях молекула субстрата окисляется, а молекула кофермента восстанавливается. При последующих сопряжённых реакциях изменения в коферменте протекают в обратном направлении и он воспроизводится в первоначальной форме. Таким образом, коферменты могут быть охарактеризованы как переносчики определённых атомов, электронов или химических групп на соответствующий акцептор. Строение апофермента определяет специфичность этой реакции, а строение кофермента – её тип.

16. Кофакторы и коферменты. Классификация.

Ответ. Кофактор — небольшое небелковое (и не производное от аминокислот) соединение (чаще всего ион металла), которое присоединяется к функциональному участку белка и участвует в его биологической деятельности. Такие белки обычно являются ферментами, поэтому кофакторы называют «молекулами-помощниками», которые участвуют в биохимических превращениях. Кофакторы классифицируются на неорганические ионы и комплексные органические молекулы, называемые коферментами. Последние обычно являются производными от витаминов. Кофактор, который прочно связан с белком (например, ковалентно), называют простетической группой. Неактивный фермент без кофактора называют апоферментом, а фермент вкупе с кофактором — холоферментом. Только в комплексе с кофактором фермент приобретает свои активные свойства и способен участвовать в реакциях. Часто кофакторами являются ионы металлов. Поэтому в небольших количествах они должны поступать в организм с пищей. Для человека список основных металлов включает железо, марганец, магний, кобальт, медь, цинк, молибден. Хотя дефицит хрома и вызывает нарушение толерантности к глюкозе, не было найдено ни одного фермента, использующего хром как кофактор. Ещё одним жизненно необходимым элементом для человека является кальций, но кальций связывается с ферментами не в виде иона, а как белок кальмодулин. Медь - Цитохром с-оксидаза, железо – Каталаза, магний - Глюкозо-6-фосфатаза, никель – Уреаза, цинк – Алкогольдегидрогеназа. Железосерные кластеры — это комплексы железа и серы, связанные с белками. Они играют важную роль в транспорте электронов, окислительно-восстановительных реакциях, и как структурные блоки. Органические кофакторы или Коферменты — вещества, предшественниками которых являются витамины. Коферменты резко специфичны к определенным реакциям, т.к. имеют определенную структуру. К коферментам относятся биотин (витамин Н), ацетил-S-КоА (пантотеновая кислота), никотинамидные коферменты (ниацин) и др. Коферменты вместе с функциональными группами аминокислотных остатков фермента формируют активный центр фермента, на котором происходит связывание с субстратом и образование активированного фермент-субстратного комплекса. Комплекс кофермента и апофермента образует целостную, биологически активную молекулу фермента, называемую холоферментом. Наиболее распространенную группу составляют соединения нуклеотидной природы, а также коферменты, содержащие остатки фосфорной кислоты. Роль коферментов нередко играют витамины или их метаболиты (чаще всего — фосфорилированные формы витаминов группы B). Например, коферментом фермента карбоксилазы является тиаминпирофосфат, коферментом многих аминотрансфераз — пиридоксаль-6-фосфат. В металлоферментах роль, аналогичную роли коферментов, могут исполнять катионы металлов, однако коферментами их обычно не называют. Коферменты обычно непрерывно синтезируются, и их концентрация поддерживается на постоянном уровне внутри клетки. Например, НАДФ «пополняется» через пентозофосфатный путь и S-аденозилметионин с помощью метионинаденозилтрансферазы. Непрерывный синтез означает, что небольшие количества коферментов могут использоваться очень интенсивно. Например, человеческое тело переворачивает свой собственный жир в АТФ каждый день. ТИАМИНОВЫЕ (производные витамина В1): ТМФ - тиаминмонофосфат; ТДФ - тиаминдифосфат; ТТФ - тиаминтрифосфат. ФЛАВИНОВЫЕ (витамин В2): ФМН - флавинмононуклеотид; ФАД - флавинадениндинуклеотид. НИКОТИНАМИДНЫЕ (витамин РР): НАД - никотинамидадениндинуклеотид; НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат. ПАНТОТЕИНОВЫЕ (витамин В5): KOF A (HS-KOA - HS, коэнзим А); ПИРИДОКСИНОВЫЕ (витамин В6): ПФ - пиридоксальфосфат; ПАФ – пиридоксаминофосфат.

17. Молекулярные механизмы ферментативного катализа.

Ответ. Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функциональных групп активного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт. Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа: кислотно-основной катализ; ковалентный катализ. Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ - часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований. К аминокислотам, участвующим в кислотно- основном катализе, в первую очередь относят цистеин, тирозин, серин, лизин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, гистидин. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме - кислоты (доноры протона), в депротонированной - основания (акцепторы протона). Благодаря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникальными биологическими катализаторами, в отличие от небиологических катализаторов, Примером кислотно-основного катализа, в котором кофакторами являются ионы Zn2+, а в качестве кофермента используется молекула NAD+, можно привести фермент алкогольдегидрогеназу печени, катализирующую реакцию окисления спирта: С2Н5ОН + NAD+ → СН3-СОН + NADH + H+. Ковалентный катализ основан на атаке нуклеофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента. Действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин и тромбин, - пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента. Термин "сериновые протеазы" связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра всех этих ферментов и участвует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере химотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке. Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими гидрофобными радикалами (Фенилаланин, Тирозин, Триптофан), что указывает на участие гидрофобных сил в формировании фермент-субстратного комплекса.

18. Способы определения активности фермента. Единицы измерения. Понятие об удельной и молярной активности.

Ответ. Для определения ферментативной активности используют следующие методы. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров). Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи). Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2). Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза). Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.). Катал — это количество фермента, которое обеспечивает превращение 1 моля субстрата в продукт за 1 секунду. Стандартная единица (U) — это количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата в продукт за 1 минуту. 1 U = 16,67 нкатал (нанокатал). В медицине активность ферментов выражают чаще всего в единицах активности на 1 л биологической жидкости. Удельная активность — выражается в единицах активности, рассчитанной на единицу массы белка (чаще всего на 1 мг). Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода. Принципы определения активности ферментов: по скорости исчезновения субстрата; по скорости накопления продуктов реакции.

20. Изоферменты.

Ответ. Изоферменты – это множественные формы одного фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающие по физическим и химическим свойствам (сродству к субстрату, максимальной скорости катализируемой реакции, электрофоретической подвижности, разной чувствительности к ингибиторам и активаторам, оптимуму рН и термостабильности). Изоферменты имеют четвертичную структуру, которая образована четным количеством субъединиц (2, 4, 6 и т.д.). Изоформы фермента образуются в результате различных комбинаций субъединиц. В качестве примера можно рассмотреть лактатдегидрогеназу (ЛДГ), фермент, который катализирует обратимую реакцию: пируват ←ЛДГ→ лактат. ЛДГ существует в виде 5 изоформ, каждая из которых состоит из 4-х протомеров (субъединиц) 2 типов М (muscle) и Н (heart). Синтез протомеров М и Н типа кодируется двумя разными генетическими локусами. Изоферменты ЛДГ различаются на уровне четвертичной структуры: ЛДГ1(НННН), ЛДГ2(НННМ), ЛДГ3(ННММ), ЛДГ4(НМММ), ЛДГ5(ММММ). Полипептидные цепи Н и М типа имеют одинаковую молекулярную массу, но в составе первых преобладают карбоновые аминокислоты, последних – диаминокислоты, поэтому они несут разный заряд и могут быть разделены методом электрофореза. Кислородный обмен в тканях влияет на изоферментный состав ЛДГ. Где доминирует аэробный обмен, там преобладают ЛДГ1, ЛДГ2 (миокард, надпочечники), где анаэробный обмен - ЛДГ4, ЛДГ5(скелетная мускулатура, печень). В процессе индивидуального развития организма в тканях происходит изменение содержания кислорода и изоформ ЛДГ. У зародыша преобладают ЛДГ4, ЛДГ5. После рождения в некоторых тканях происходит увеличение содержания ЛДГ1, ЛДГ2. Существование изоформ повышает адаптационную возможность тканей, органов, организма в целом к меняющимся условиям. По изменению изоферментного состава оценивают метаболическое состояние органов и тканей. Изоформы креатинкиназы. Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата: Молекула КК - димер, состоящий из субъединиц двух типов: М (от англ, muscle - мышца) и В (от англ, brain - мозг). Из этих субъединиц образуются 3 изофермента - ВВ, MB, MM. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ - в скелетных мышцах и MB - в сердечной мышце. Изоформы КК имеют разную электрофоретическую подвижность. Активность КК в норме не должна превышать 90 МЕ/л. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

21. Моносахариды. Представители и свойства. Функции углеводов.

Ответ. Моносахариды (монозы) являются бифункциональными соединениями. В их молекулах одновременно содержатся карбонильная (альдегидная или кетонная) и несколько гидроксильных групп, т. е. моносахариды представляют собой полигидроксикарбонильные соединения — полигидроксиальдегиды и полигидроксикетоны. В зависимости от этого моносахариды подразделяются на альдозы (в моносахариде содержится альдегидная группа) и кетозы (содержится кетогруппа). Например, глюкоза — это альдоза, а фруктоза — это кетоза. В зависимости от числа атомов углерода в молекуле моносахарид называется тетрозой, пентозой, гексозой и т. д. Если объединить последние два типа классификации, то глюкоза — это альдогексоза, а фруктоза — кетогексоза. Большинство встречающихся в природе моносахаридов — это пентозы и гексозы. Моносахариды являются углеводами, которые не гидролизуются с образованием более простых углеводов. Глюкоза, или виноградный сахар, входит в состав сока многих фруктов и ягод, в том числе винограда, и является самым распространённым углеводом. Глюкоза относится к шестиатомным моносахаридам, то есть относится к ряду гексоз. В свободном виде глюкоза содержится в плодах, цветах и других органах растений, в мёде, а также в животных тканях (в крови, мозге, мышцах). В природе глюкоза существует преимущественно в виде Д–изомера и является важнейшим источником энергии в организмах животных, человека и микроорганизмов. Глюкоза — бесцветное кристаллическое вещество сладкого вкуса, хорошо растворимое в воде. Растворы глюкозы используются в медицине для внутривенных инъекций, так как обеспечивают дополнительное питание организма быстро усваиваемыми углеводами. Повышение концентрации глюкозы в крови приводит к усилению выработки гормона поджелудочной железы — инсулина, отвечающего за быстрый метаболизм углеводов в организме. В организме глюкоза подвергается сложным биохимическим превращениям, в результате которых образуется углекислый газ и вода и выделяется энергия в соответствии с итоговым уравнением: Этот процесс протекает ступенчато, с медленным выделением энергии. Большое значение имеют биохимические процессы брожения глюкозы. Так, при квашении капусты, огурцов, молока, при силосовании кормов происходит молочнокислое брожение глюкозы (образуется молочная кислота). При производстве пива и вина используется спиртовое брожение глюкозы, в результате которого образуется этиловый спирт. При взаимодействии глюкозы со спиртами образуются простые эфиры: Глюкоза реагирует с карбоновыми кислотами с образованием сложных эфиров, то есть пять гидроксильных групп глюкозы вступают в реакцию с кислотами аналогично спиртам. Как многоатомный спирт реагирует без нагревания с гидроксидом меди (2) c образованием алкоголята меди (2) ярко-синего цвета (качественная реакция на многоатомные спирты). Глюкоза легко окисляется до глюконовой кислоты под действием гидроксида меди (2) при нагревании, в результате чего образуется также оксид меди) красного цвета. Глюкоза легко вступает в реакцию «серебряного зеркала», окисляясь под действием аммиачного раствора оксида серебра (1). Глюкоза способна окисляться под действием азотной кислоты и с бромной воды. Азотная кислота окисляет глюкозу до дикарбоновой кислоты – глюкаровой (или сахарной) кислоты.

Глюкоза обладает некоторыми специфическими свойствами.

Глюкоза может быть получена гидролизом природных веществ, в состав которых она входит. Её получают гидролизом картофельного и кукурузного крахмала кислотами. Фруктоза содержится во фруктах, в пчелином мёде, входит в состав сахара (сахарозы). Фруктоза является изомером глюкозы и имеет ту же молекулярную формулу. Она представляет собой кетогексозу, в которой кето-группа находится у второго углеродного атома в цепи. Фруктоза, как и глюкоза, существует в двух таутомерных формах — в открытой и замкнутой (циклической). От глюкозы фруктоза отличается меньшим размером цикла, который содержит не шесть, а пять атомов (включая кислород). Фруктоза хорошо растворима в воде и имеет более сладкий вкус, чем глюкоза. Поскольку фруктоза, как и глюкоза, является многоатомным спиртом, то вступает в те же реакции с участием гидроксильных групп. Особенностью фруктозы является невозможность окисления кетогруппы до кислоты. В живых организмах углеводы выполняют следующие функции. Структурная и опорная функции. Углеводы участвуют в построении различных опорных структур. Так, целлюлоза является основным структурным компонентом клеточных стенок растений, хитин выполняет аналогичную функцию у грибов, а также обеспечивает жёсткость экзоскелета членистоногих. Защитная роль у растений. У некоторых растений есть защитные образования (шипы, колючки и др.), состоящие из клеточных стенок мёртвых клеток. Пластическая функция. Углеводы входят в состав сложных молекул (например, пентозы (рибоза и дезоксирибоза) участвуют в построении АТФ, ДНК и РНК). Энергетическая функция. Углеводы служат источником энергии: при окислении 1 грамма углеводов выделяются 4,1 ккал энергии и 0,4 г воды. Запасающая функция. Углеводы выступают в качестве запасных питательных веществ: гликоген у животных, крахмал и инулин — у растений. Осмотическая функция. Углеводы участвуют в регуляции осмотического давления в организме. Так, в крови содержится 100—110 мг/л глюкозы, от концентрации глюкозы зависит осмотическое давление крови. Рецепторная функция. Олигосахариды входят в состав воспринимающей части многих клеточных рецепторов или молекул-лигандов.