Статья: Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих

03.00.02 биофизика

03.00.23 биотехнология

Борисенко Андрей Владимирович

Москва 2007

Введение

Актуальность темы

В последние годы наблюдается возрастающий интерес исследователей к действию сверхмалых доз (СМД) биологически активных веществ.

Опубликованы данные для разнообразных групп биологически активных веществ (гормонов, эндогенных регуляторных пептидов, ряд веществ не пептидной природы и др.). Исследование влияния СМД представляет интерес, так как может привести к созданию новых лекарственных веществ или к выявлению новых существенно важных свойств уже известных. Наблюдаемые эффекты возможно объяснить при помощи различных гипотез: концентрирование лекарственного вещества, наличие высокоэффективных систем проведения и усиления рецепторного сигнала, "адаптации" рецепторов к действию СМД [Сазанов, Зайцев, 1992; Бурлакова и др., 2004], существованием супервысокоаффинных рецепторов и др. [Бурлакова и др., 1990]. Но неоспоримым является факт достоверного воздействия СМД на биологический объект, которые могут совпадать или не совпадать с действием больших доз. Для многих веществ было показано, что эффекты сверхмалых доз примерно совпадают по силе и величине с наблюдаемыми при действии больших доз [Sergeeva et al., 1996].

Благодаря разработке методов выделения и биотестирования удалось выделить и охарактеризовать ранее не идентифицированные регуляторные факторы, белковой природы, проявляющие биологическую активность в СМД [Ямскова и др., 1978; Ямскова, Резникова, 1991]. Действие регуляторных белков (РБ) данной группы в СМД реализуется в рамках концепции, в основе которой лежат представления о нарушениях регуляции органно-тканевого гомеостаза как первопричины развития любой патологии и об изменении состояния воды в биологических жидкостях под действием РБ в СМД, причем вода является матрицей для переноса регуляторного сигнала [Ямскова и др., 1998; Ямсков и др., 1999, Бурлакова и др., 2004].

Цель и задачи исследования. Исследование мембранотропной, специфической биологической активности регуляторных белков, действующих в сверхмалых дозах, а также некоторых физико-химических свойств.

В отдельные задачи входили:

1. Выделение регуляторных белков из печени, легкого, тонкого кишечника, желчи млекопитающих и получение их в высокоочищенном состоянии.

2. Изучение дозовой зависимости мембранотропной активности регуляторных белков.

3. Изучение физико-химических свойств регуляторных белков.

4. Изучение локализации регуляторных белков в ткани печени позвоночных животных.

5. Разработка новой экспериментальной модели роллерного органного культивирования ткани печени тритона in vitro для исследования специфической биологической активности регуляторных белков, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих.

6. Изучение биологического действия регуляторных белков, выделенных из печени, желчи и сыворотки крови млекопитающих на органной культуре печени тритона in vitro.

Научная новизна работы

Впервые в тканях печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих, были идентифицированы РБ, действующие в СМД. Было показано, что в тканях РБ присутствуют в виде нескольких фракций, преобладающими из которых являются фракции кислых и основных белков. Изучение физико-химических свойств данных РБ показало, что они представляют собой низкомолекулярные белки, во вторичной структуре которых преобладают Я-структуры и статистический клубок. Показано, что в водных растворах РБ ассоциированы и присутствуют в виде наноразмерных частиц. По физико-химическим свойствам данные белки сходны с РБ, которые были ранее идентифицированы в других тканях млекопитающих. Для РБ печени и сыворотки крови была изучена их локализация в ткани печени позвоночных животных и показано, что оба белка являются внеклеточными. Впервые была разработана модель роллерного органного культивирования ткани печени тритона, на которой было изучено специфическое действие РБ, выделенных из ткани печени, сыворотки крови и желчи. Установлено, что только РБ печени и сыворотки крови проявляют специфическое действие на состояние печени тритона при культивировании: РБ печени стимулирует клетки макрофагального ряда, а РБ сыворотки стимулирует клетки кроветворного ряда. В отдельном эксперименте была продемонстрирована способность РБ желчи уменьшать размеры частиц желчи человека in vitro. Таким образом, благодаря применению различных экспериментальных моделей для изучения специфической активности РБ, выделенных из различных источников, было установлено, что их биологическое действие различается, несмотря на проявление ими сходных физико-химических свойств и мембранотропной активности в СМД.

Практическая значимость

В данной работе впервые показано специфическое действие в СМД РБ, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи. Полученные данные позволяют поставить вопрос о разработке новых фармакологических препаратов на основе данных РБ. Результаты проведенного исследования указывают на проявление РБ печени гепатопротекторных свойств, а также на возможность применения РБ сыворотки крови для лечения некоторых гематопатологий, а РБ желчи - для лечения и профилактики желчекаменной болезни. Разработанная роллерная органная культура ткани печени тритона может быть рекомендована в качестве модели для первичного скрининга веществ, для которых предполагается проявление гепатопротекторных свойств. В отдельной серии экспериментов была продемонстрирована выраженная лечебно-профилактическая активность РБ тонкого кишечника на развитие инфекции, вызванной высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц A/H5N1. В этом же опыте была показана профилактическая активность РБ сыворотки крови.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены: на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 8 декабря, 2004; на V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» Уфа, 5-8 сентября, 2005; на конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» 17-18 ноября, 2005, Москва; на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Москва, 21 декабря, 2005; на V ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 14-16 декабря, 2005; на IV Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля, 2006.

Структура и объем диссертации

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Обзор литературы, в котором рассмотрены общие положения клеточной адгезии, компоненты внеклеточного матрикса, а также белки участвующих в адгезии по типу "клетка-клетка". Рассмотрена пространственная организация межклеточного пространства в печени млекопитающих. Охарактеризованы известные до настоящей работы РБ, биологически активные в СМД, а также адгезиометрические методы исследования РБ из ткани печени.

Экспериментальная часть, посвящена описанию материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены результаты, полученные при идентификации РБ в печени, легком, тонком кишечнике и желчи, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучения мембранотропной и специфической активности, проявляемой в СМД.

Заключение - раздел, который также входит в данную главу в котором представлены предположения о возможном механизме биологического действия изучаемых РБ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

1. Результаты и их обсуждение

Выделение и очистка регуляторных белков печени, легкого, тонкого кишечника крыс Wistar, а также желчи КРС

РБ выделяли из ткани печени, легкого, тонкого кишечника, а также из желчи, по методике, разработанной для РБ данной группы, которая исключает механическую и ферментативную обработку ткани и способствует переходу в экстракт секретируемых белков [Ямскова и др., 1977; Ямсков и др., 1999]. После высаливания основной массы белков из экстрактов РБ остаются в растворенном состоянии. Полученные супернатанты подвергали фракционированию с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ). В процессе очистки фракции, содержащие РБ, идентифицировали с помощью метода биотестирования, специально разработанного ранее для определения биологически активных в СМД РБ [Ямскова, Резникова, 1991].

Изучение мембранотропной активности фракций регуляторных белков, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих

Во всех изучаемых тканевы экстрактах, а также в желчи, были обнаружены фракции кислых и основных РБ. Следует отметить, что кислые белки всегда были представлены в больших количествах в сравнении с другими фракциями РБ. На рис. 1 в качестве примера приведена картина разделения супернатанта печени крыс с помощью ИЭФ.

В таблице 1 представлены данные биотестирования фракций кислых РБ, которые показывают, что идентифицированные РБ проявляют мембранотропную активность в концентрациях, соответствующих 10^-12-10^-16 мг белка в мл, аналогичные данные были получены для основных РБ.

Биотестирование РБ показало, что мембранотропный эффект имеет полимодальную дозовую зависимость, а проявление биологической активности наблюдается как в области низких, так и в области сверхнизких концентраций.

В качестве примера приводится диаграмма биотестирования для кислого регуляторного белка, выделенного из печени (рис. 2).

Рис.1. Изоэлектрофокусирование супернатанта печени крыс Wistar. По ординате 1 - значения рН, соответствующие номерам фракций. По ординате 2-значения оптической плотности соответствующих фракций при длине волны 280 нм; по абсциссе - номера фракций.

Таблица 1. Биотестирование кислых и основных фракций супернатантов содержащих регуляторные белки

При изучении супернатанта печени было идентифицировано четыре фракции содержащих белки, проявляющих мембранотропную активность в СМД: в области рН<3.0 (кислый РБ); в области рН 4.5-5.1 (слабокислый РБ); в области рН 6.7-7.2; в области рН>8.0 (основной РБ) (рис. 1).

Рис. 2. Мембранотропное действие кислого регуляторного белка печени (метод биотестирования). По ординате - величина эффекта Эа (%) [Ямскова, Резникова 1999]; по абсциссе - показатель степени десятикратного разбавления. к - контроль; столбцы - воздействие фракции в разбавлении 10^х, где х - показатель степени десятикратного разбавления изучаемого препарата.

Основные характеристики ИЭФ-фракций, содержащих РБ, выделенных из супернатанта печени крыс приведены в табл. 2.

Таблица 2. Характеристики ИЭФ-фракций супернатанта печени, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах*