Статья: Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих

*- данные приводятся для тканевого экстракта, полученного из 230 г влажного веса ткани.

Как видно из таблицы 2, в тканевом экстракте печени кроме кислых и основных РБ присутствуют еще два РБ, проявляющих мембранотропную активность в СМД. Можно предположить, что РБ со значением изоэлектрической точки в интервале рН 4.5-5.1, представляет собой РБ, ранее обнаруженный в сыворотках крови позвоночных животных, который характеризовался отсутствием тканевой специфичности мембранотропного действия (т.е. изменял свойства плазматической мембраны как клеток печени, так и клеток легкого in vitro) [Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 2001].

Возможно, что данный РБ синтезируется клетками печени, как и многие белки сыворотки крови [Энгельгардт, 1984]. Для изучения этого вопроса был поставлен отдельный эксперимент, в котором было проведено сравнительное исследование фракций РБ, собранных в интервале рН 4.5-5.1 после ИЭФ, как тканевых экстрактов печени и легкого крыс, так и их супернатантов (таб. 3). Для изучения тканевой специфичности мембранотропного действия фракций, собранных в интервале рН 4.5-5.1, применяли метод биотестирования на органных культурах ткани печени и легкого мышей.

Таблица 3. Сравнительное исследование фракций регуляторных белков выделенных из печени и легкого, собранных в области рН 4,5-5,1

Было установлено, что фракции РБ, выделенные из тканевого экстракта печени и его супернатанта, в СМД проявляли мембранотропное действие, как на клетки печени, так и на клетки легкого in vitro, т.е. характеризовались отсутствием тканевой специфичности биологического действия. Фракция РБ, собранная в интервале рН 4.5-5.1, после изоэлектрофокусирования, как тканевого экстракта легкого, так и его супернатанта, была биологически неактивна. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют в пользу высказанного предположения о том, что в печени позвоночных животных синтезируется РБ сыворотки крови. Эти данные нашли подтверждение в иммуногистохимическом исследовании локализации в ткани печени РБ сыворотки крови.

Фракция в области рН 6.7-7.2, возможно, представляет собой ранее изученный РБ печени, биологически активный в СМД, который характеризовался значением изоэлектрической точки в интервале рН 6.7-7.2, а также отсутствием резистентности к воздействию различных физико-химических факторов (температура, воздействие деионизованной среды, хелатирующих агентов) [Ямскова и др., 1977а; Ямскова, 1978; Ямскова и др.,1978].

Таким образом, в настоящем исследовании были обнаружены ранее не идентифицированные фракции кислых и основных РБ, выделенные из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих.

Изучение физико-химических свойств фракций, содержащих регуляторные белки, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника и желчи млекопитающих

Изучение физико-химических свойств РБ проводили на фракциях, полученных после ИЭФ супернатантов тканевых экстрактов.

Методом электрофореза в ПААГ было показано, что основным компонентом изучаемых фракций РБ является низкомолекулярный белок.

На рис. 3 показано разделение кислых и основных РБ при электрофорезе в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия.

После электрофореза в ПААГ в отсутствии додецилсульфата натрия, было проведено элюирование из геля фракций, характеризующихся высокой электрофоретической подвижностью (Rf 0.90±0.05). Методом биотестирования было установлено, что данные низкомолекулярные РБ проявляли мембранотропную активность в СМД.

Рис. 3. Разделение фракции кислых белков, полученной после изоэлектрофокусирования супернатантов, в 12% ПААГ с добавлением додецилсульфата натрия. Окраска Кумасси G250. На рисунке: маркеры, 1- кислый РБ печени; 2- кислый РБ легкого; 3- кислый РБ тонкого кишечника; 4- кислый РБ желчи.

При обращено-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода-ацетонитрил фракции РБ были разделены на две фракции гидрофильную и гидрофобную, соответственно, характеризующиеся временами удержания 3.0-4.0 и 13.0-15.0 мин. На рис. 4 в качестве примера представлена картина разделения кислой фракции РБ легкого.

Рис. 4. Разделение кислой фракции регуляторных белков легкого методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. По оси абсцисс - время удержания, мин; по оси ординат интенсивность поглощения при 280 нм, отн. ед.

Было показано, что обе фракции проявляют мембранотропную активность в СМД. Возможно, данные фракции представлены различающимися между собой белками. Однако не исключено, что гидрофильная и гидрофобная фракции представляют собой, соответственно, высокомолекулярные ассоциаты и низкомолекулярную фракции РБ. В пользу этого предположения свидетельствуют ранее полученные данные о проявлении молекулами РБ выраженной тенденции к агрегации [Ямскова, Резникова, 1991].

Методами лазерного динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии были изучены водные растворы фракций кислых РБ и показано, что в них присутствуют наноразмерные частицы.

Результаты исследования, проведенные методом динамического рассеяния, показали, что распределение частиц во всех кислых фракциях РБ было унимодальным, средний гидродинамический радиус частиц составлял 40-60 нм. На рис. 5 представлена кривая распределения по размеру гидродинамического радиуса частиц, присутствующих во фракции РБ печени.

Рис. 5. Кривая распределения частиц регуляторного белка, выделенного из печени, по гидродинамическому радиусу (метод лазерного динамического светорассеяния).

Следует отметить, что в сравнении с другими белками, например, с белками плазмы крови, а также полисахаридами, которые отличались друг от друга по составу, структуре и молекулярной массе [Armstrong, 2004], РБ имеют большое значение гидродинамического радиуса. Одним из объяснений этого экспериментально установленного факта может быть выраженная тенденция низкомолекулярных РБ образовывать в водных растворах высокомолекулярные ассоциаты.

Результаты исследования водных растворов РБ, проведенного динамическим лазерным светорассеянием, согласуются с данными, полученными методом атомно-силовой микроскопии. Этим методом показано, что на подложке после удаления растворителя из фракции РБ обнаруживаются частицы, размером 30-100 нм (рис. 6).

Рис. 6. Атомно-силовая микроскопия фракции регуляторного белка, выделенного из желчи.

Полученные результаты, на наш взгляд, важны для объяснения действия РБ в СМД. Можно предположить, что биологическая активность РБ обусловлена их способностью образовывать устойчивые наночастицы. Результаты исследований, проведенные в различных областях науки, свидетельствуют о том, что вещества в виде наноразмерных частиц (10-1000 нм) проявляют уникальные физико-химические свойства и биологическое действие [Cui et al., 2004, Olivier 2005; Рамис, 2005]. Следует отметить сходство между наноразмерными частицами, присутствующими в водно-белковых системах как in vitro, так и in vivo [Рамис, 2005]. Было предположено, что образование таких частиц может быть результатом проявления способности материи к самоорганизации в неравновесных системах [Рамис, 2006].

Как показывают данные литературы, вторичная структура белков, проявляющих тенденцию к образованию высокомолекулярных ассоциатов, характеризуется высоким содержанием в-структур и неупорядоченных участков полипептидной цепи [Рамис, 2005].

Методом кругового дихроизма была охарактеризована вторичная структура кислых РБ (табл. 4).

Таблица 4. Исследование вторичной структуры кислых регуляторных белков методом кругового дихроизма.

Было показано, что вторичная структура данных белков описывается, в основном, в терминах Я-структур и статистического клубка. Эти данные полностью совпадают с данными полученными при исследовании вторичной структуры РБ, выделенных из других тканей млекопитающих [Скрипникова и др., 2005; Краснов и др., 2005; 2006; Рыбакова, 2005; Назарова и др. 2005; 2006]. Следует отметить, что такое состояние вторичной структуры РБ изучаемой группы является их отличительным свойством от других белков, участвующих в процессах регуляции.

Исследование локализации кислого РБ печени и слабокислого РБ сыворотки крови

Исследование локализации в ткани было проведено для кислого РБ, выделенного из печени, и для РБ сыворотки крови, характеризующегося значением рI в области рН 4.5-5.1. Соответствующие поликлональные антисыворотки были получены по методу Гослинга [Gosling, 2000]. С помощью иммуногистохимической реакции с использованием вторичных FITC-конъюгированных антител была изучена локализация данных белков в ткани печени крысы и тритона. Было обнаружено, что РБ печени локализуется в области синусоида печени крысы (рис. 7), а РБ сыворотки крови локализуется в межгепатоцитарном пространстве ткани печени тритона (рис. 8).

Полученные данные согласуются с представленными выше результатами исследования РБ со значением рI в области рН 4.5-5.1, обнаруженного в тканевом экстракте печени, а также свидетельствуют в пользу предположения о том, что РБ сыворотки крови синтезируется клетками печени.

Рис. 7. Локализация регуляторного белка печени в ткани печени крысы. (ув. ок. х10, об. х40; зона локализации показана стрелкой).

Рис. 8. Локализация регуляторного белка сыворотки крови в ткани печени тритона. (ув. ок. х10, об. х40; зона локализации показана стрелкой).

2. Разработка модели для изучения специфического действия регуляторных белков

Для изучения специфического действия РБ была разработана модель культивирования in vitro ткани печени тритона Pl. waltl. Ткани хвостатых амфибий проявляют большую способность к регенерации, по сравнению с млекопитающими [Stocum, 1995]. При органном культивировании клетки печени взрослых особей амфибий обладают существенно большей жизнеспособностью, по сравнению с клетками печени взрослых млекопитающих [Trowell, 1959; Campbell, Hales, 1971]. Ранее было показано, что органные культуры печени взрослых амфибий можно поддерживать в течение длительного времени [Monnickendam, 1972, 1973 a, b]. При роллерном типе культивирования тканей амфибий происходит активация клеточных источников регенерации и культура ткани остается жизнеспособной в течение длительного времени [Григорян и др., 2005]. Поэтому было проведено сравнение двух моделей культивирования: роллерная модель и культивирование ткани печени на подложке.

Основное отличие функции печени хвостатых амфибий от млекопитающих заключается в сохранении у них кроветворения во всем постнатальном периоде и присутствии пигментных клеток, которые способны синтезировать меланины и располагаются как в кортикальном слое, так и в паренхиме печени. Согласно литературным данным распределение пигмента в этих клетках печени сезонно изменяется: оно значительно уменьшается ко второй половине зимы и увеличивается весной и летом [Воронцова и др., 1952]. Установлено, что пигментированные клетки печени амфибий являются аналогами купферовских клеток печени млекопитающих и функционируют как макрофаги, поглощая различные частицы, например, микроорганизмы, вирусы, а также осуществляют детоксикацию различных ксенобиотиков [Sichel et al., 2002]. Эти клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток [Sichel et al., 1997], отличаются от других фагоцитов позвоночных тем, что способны синтезировать меланин в меланосомах, но, в то же время, они не являются меланоцитами, происходящими из клеток нервного гребня [Sichel et al., 2002].

Для оценки состояния ткани определяли следующие параметры: площадь кластеров пигментированных клеток и количество митозов в клетках кортикальной области. Согласно данным литературы, эти параметры отражают способность ткани печени амфибий реагировать на повреждающие воздействия [Frangioni et al., 2003].