Статья: Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих

Как показывают результаты этих экспериментальных серий, представленные в табл. 5, роллерный способ культивирования ткани печени тритона способствует увеличению площади кластеров пигментированных клеток, по сравнению с тканью печени, культивированной на подложке, а также по сравнению с интактной тканью (р<0.05).

Таблица 5. Оценка состояния интактной ткани печени тритона, а также после органного культивирования

Количество митозов в клетках кортикальной области было меньшим, по сравнению с интактной тканью (р<0.05), но большим, по сравнению с тканью печени, культивированной на подложке (р< 0.05). Полученные данные указывают на поддержание жизнеспособности клеток и гистоструктуры печени амфибий при роллерном типе культивирования, по сравнению с культивированием ткани на подложке (рис. 9).

Не исключено, что в условиях роллерного культивирования происходит увеличение количества пигмента в печеночных меланомакрофагах за счет стимуляции в них метаболитической активности. При культивировании на подложке в ткани печени амфибий происходит угнетение данных процессов и наблюдается массовая гибель клеток во всей ткани (рис. 10).

Рис. 9. Роллерное культивирование ткани печени тритона в течение 3 суток без добавления каких-либо факторов. А - краевая зона, Б - область сосудов. Об. х10; ок. х20.

Рис. 10. Культивирование ткани печени тритона на подложке в течение 3 суток без добавления каких-либо факторов. А - краевая зона, Б - область сосудов. Об. х10; ок. х20.

Эти предположения нашли подтверждение при изучении специфического действия РБ. В данной опытной серии были исследованы РБ, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих. Такой выбор был основан на данных литературы, свидетельствующих о том, что клетки печени синтезируют как компоненты сыворотки крови и желчи, так и вещества, обеспечивающие регуляцию гомеостаза печени [Энгельгард, 1984; Ямскова и др., 1977].

Исследование специфической биологической активности регуляторных белков, выделенных из тканей млекопитающих

При органном культивировании ткани печени на подложке, как в контрольных, так и в опытных культурах наблюдали развитие процессов деградации ткани. В краевой зоне не обнаруживались митозы соединительнотканных клеток. Эти данные указывают на угнетение клеток кроветворения. Кластеры пигментированных клеток наблюдались в паренхиме. В присутствии РБ сыворотки крови и желчи, соответственно, наблюдали одинаковое уменьшение параметра, отражающего площадь кластеров пигментированных клеток по сравнению с контролем. В присутствии РБ печени, отмечали образование кластеров, площадь которых соответствовала контрольному параметру. Эти результаты указывают на то, что состояние адгезии ткани к подложке является решающим фактором в проявлении биологической активности изучаемых РБ (рис. 11; табл. 6).

Рис. 11. Культивирование ткани печени тритона на подложке в течение 3 суток c добавлением регуляторных белков. А - влияние РБ печени, Б - влияние РБ сыворотки крови, В - влияние РБ желчи. Об. х10; ок. х20.

Совершенно иные результаты были получены при исследовании специфической биологической активности РБ, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих, на экспериментальной модели роллерного органного культивирования ткани печени тритона. Было показано, что данные РБ различным образом влияют на состояние ткани железы (табл. 6).

Таблица 6. Влияние кислых регуляторных белков на органные культуры печени тритона in vitro при различных условиях культивирования

РБ печени способствовал увеличению площади кластеров пигментированных клеток, но в то же время, угнетал митозы соединительнотканных клеток кортикальной области (табл. 6). Можно предположить, что биологическая активность РБ печени выражается в активации меланомакрофогов и угнетении процессов кроветворения в печени амфибий. Возможно, что РБ печени стимулирует миграцию меланомакрофагов в печени, которая приводит к образованию крупных кластеров (рис. 12).

Возможно также, что РБ печени стимулирует биосинтез меланина в данных условиях культивирования, и увеличение количества пигмента в клетках способствует их визуальной идентификации. Не исключается и такой вариант объяснения: увеличение кластеров пигментированных клеток связано с усилением фагоцитарной активности меланомакрофагов и накоплением ими продуктов деградации гемоглобина, ферритина, гемоседирина.

Рис. 12. Роллерное культивирование ткани печени тритона с добавлением регуляторного белка, выделенного из печени: А - краевая зона (Об. х10; ок. х20), Б - область сосудов (Об. х10; ок. х10).

Кроме того, возможно также, что РБ печени стимулирует дифференцировку клеток-предшественников макрофагов, которые дифференцировались в зрелые меланомакрофаги. Согласно литературным источникам, эти клетки являются рекрутированными макрофагами, относящимися к мононуклеарно-фагоцитарной системе, способны автономно синтезировать меланин [Sichel et al., 2002]. Следует отметить, что у пойкилотермных животных в состав плазматической мембраны гепатоцитов входит большое количество ненасыщенных жирных кислот, которые обеспечивают ее высокую текучесть. В настоящее время установлено, что меланины проявляют свойства антиоксидантов, действуя как высокоэффективные поглотители иона О^2- [Frangioni et al., 2003].

Суммируя представленные литературные данные, а также результаты исследования специфической активности РБ печени, можно предположить, что этот РБ в СМД проявляет гепатопротекторные свойства.

РБ сыворотки крови способствовал увеличению числа митозов соединительнотканных клеток кортикальной области, а также поддерживал жизнеспособность клеток паренхимы (табл. 6). Стимуляцию митозов соединительнотканных клеток при воздействии РБ сыворотки крови можно объяснить способностью данного РБ поддерживать процессы кроветворения в капсулярной области печени амфибий при данном способе культивирования (рис. 13). В этом аспекте следует отметить, что ранее полученные данные при исследовании сывороточного РБ данной группы свидетельствовали о его стимуляции пролиферативной активности соединительнотканных клеток млекопитающих in vitro [Буеверова и др., 1985]. Изучение этих вопросов явится предметом наших дальнейших исследований.

Рис. 13. Роллерное культивирование ткани печени тритона с добавлением регуляторного белка, выделенного из сыворотки крови: А - область паренхимы, Б - краевая зона, В - область сосудов. Об. х10; ок. х20.

В настоящем исследовании было показано, что РБ желчи способствовал уменьшению площади пигментированных клеток в печени тритона, как при роллерном, так и при стационарном способе культивирования (табл. 6). РБ желчи способствовал уменьшению числа митозов соединительнотканных клеток, по сравнению с контролем. Можно высказать предположение о том, что данный РБ обладал угнетающим действием как на меланомакрофаги, так и на клетки краевой зоны печени тритона в условиях in vitro (рис. 14).

Рис. 14. Роллерное культивирование ткани печени тритона с добавлением регуляторного белка, выделенного из желчи: А - краевая зона, Б - область сосудов. Об. х10; ок. х20.

На основании данных, полученных в проведенном исследовании, не представляется возможным предположить механизм, лежащий в основе биологического действия РБ желчи. Поэтому был поставлен отдельный эксперимент по изучению влиянию кислого РБ желчи на размер частиц желчи человека in vitro. Исследование было проведено совместно с Московской медицинской академией им. Сеченова и Российской экономической академией им. Плеханова. В этом же эксперименте были изучены также РБ, выделенные из сыворотки крови и печени млекопитающих. Было показано, что при действии кислого РБ желчи in vitro средний диаметр частиц статистически достоверно уменьшался приблизительно вдвое по сравнению с контролем (табл. 7). РБ, выделенные из сыворотки крови и печени, не оказывали влияние на размер частиц желчи в данном эксперименте. Таким образом, на данной модели удалось продемонстрировать специфическое действие кислого РБ желчи.

Суммируя полученные результаты можно отметить следующее: РБ, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи, проявляют специфическую биологическую активность в СМД и, очевидно, представляют собой различающиеся между собой белки, несмотря на то, что все они являются продуктами синтеза клеток печени и проявляют сходные физико-химические свойства.

Таблица 7. Изменение размера частиц желчи человека при воздействии регуляторных белков, выделенного из желчи, сыворотки крови и печени млекопитающих in vitro

Для ряда регуляторных белков была продемонстрирована противовирусная активность. Исследование было проведено совместно с НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Изучали влияние РБ, выделенных из сыворотки крови и тонкого кишечника млекопитающих, на инфекционные свойства вируса гриппа А/Н5N1 на культуре эмбриональных клеток эпителия почек свиньи (СПЭВ). В качестве препаратов сравнения исследовали РБ, выделенный из тимуса, а также композицию трех РБ в СМД. Были поставлены три варианта экспериментов: 1- препараты РБ вносили в культуральную среду за 1 час до заражения вирусом; 2- в момент инфицирования клеток; 3- через 1 час после заражения культур вирусом гриппа А/Н5N1. Как видно из результатов, приведенных в табл. 8, максимальная противовирусная активность препаратов РБ была зарегистрирована при обработке клеточной культуры за 1 час до заражения вирусом.

В этих условиях эксперимента при добавлении в культуральную среду препаратов РБ тимуса или РБ тонкого кишечника в течении 48 часов после заражения вирусом выживало 100% клеток.

Таблица 8. Противовирусное действие препаратов РБ тимуса, РБ сыворотки крови, «композиция», РБ тонкого кишечника в отношении инфекции, вызванной высокопатогенным вариантом вируса гриппа птиц А/Н5N1 в культурах клеток почек эмбрионов свиньи