Обработка препаратом «композиция» приводила к сохранению жизнеспособными 90% клеток, и только 25% клеток выживало в случае обработки их препаратом РБ сыворотки крови. Внесение в культуральную среду препаратов РБ тонкого кишечника и препарата «композиция» через 1 час после заражения клеточных культур вирусом приводили, соответственно, к 100% защите клеток в течении 48 часов после заражения вирусом. Внесение изучаемых препаратов РБ в культуральную среду в момент заражения клеток позволило выявить четкий противовирусный эффект препарата РБ тонкого кишечника. Таким образом, изучение противовирусной активности 4-х препаратов на развитие инфекции, вызванной высокопатогенным вариантом вируса гриппа птиц А/Н5N1, позволило выявить высокую лечебно-профилактическую активность препаратов РБ тонкого кишечника и «композиция» и профилактическую активность препаратов РБ тимуса, РБ тонкого кишечника и «композиция».
Заключение
Суммируя полученные в данном исследовании результаты, можно заключить следующее.
В тканевых экстрактах печени, легкого, тонкого кишечника, а также в желчи, обнаружены РБ, проявляющие биологическую активность в СМД. В данных экстрактах РБ обнаруживаются в виде 2-х фракций: кислых и основных белков. В тканевом экстракте печени обнаружены 4 фракции РБ данной группы. Кроме кислых и основных РБ, обнаружены два РБ со значением pI в области рН 4.5-5.1 и рН 6.7-7.2, соответственно.
Было проведено сравнительное исследование двух РБ, характеризующихся значением pI в области рН 4.5-5.1, выделенных, соответственно, из сыворотки крови и печени. На основании полученных результатов, а также данных изучения локализации сывороточного РБ в ткани печени, было высказано предположение о том, что данный РБ синтезируется клетками печени и, очевидно, является компонентом сыворотки крови.
Согласно результатам исследования физико-химических свойств кислых и основных РБ, они представляют собой низкомолекулярные белки, вторичная структура которых характеризуется преобладанием в-структур и статистического клубка. Установлено, что в водных растворах молекулы РБ образуют наноразмерные структуры.
Изучение биологических свойств РБ показало, что дозовая зависимость мембранотропной активности имеет полимодальный характер. Было продемонстрировано, что РБ проявляют биологическую активность в концентрациях, соответствующих 10-11-10-17 мг белка в мл.
Для изучения специфического действия РБ была разработана роллерная органная культура ткани печени тритона. Культивирование ткани печени амфибий имеет ряд преимуществ, в силу того, что ткани амфибий проявляют выраженную тенденцию к регенерации, восстановительным и репаративным процессам. С помощью оценки таких параметров, как митотическая активность соединительнотканных клеток и площадь кластеров пигментированных клеток, было охарактеризовано состояние ткани печени амфибий при культивировании.
В данном исследовании была изучена специфическая активность трех РБ: сыворотки крови, печени и желчи. Только на модели органного культивирования печени тритона удалось различить, соответственно, специфическое действие РБ печени и сыворотки крови. Специфическая активность РБ желчи была продемонстрирована в экспериментах, в которых была проведена оценка размера частиц желчи человека in vitro.
На модели культуры эпителиальных клеток млекопитающих была показана высокоэффективная противовирусная активность РБ тонкого кишечника в СМД.
Таким образом, в настоящей работе в тканях печени, легкого, тонкого кишечника, а также желчи, были идентифицированы ранее не изученные РБ, действующие в СМД. Было проведено исследование их физико-химических свойств, разработаны новые экспериментальные модели, на которых была изучена специфическая биологическая активность. Полученные в этом исследовании результаты показывают, что, несмотря на сходство физико-химических свойств и характера мембранотропного действия изучаемых РБ тканей млекопитающих, они представляют различающиеся между собой белки.
Выводы
1. В тканях печени, легкого, тонкого кишечника, а также в желчи, идентифицированы ранее не изученные регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах, соответствующих 10-11-10-17 мг белка в мл. Показано, что в тканях млекопитающих регуляторные белки присутствуют в виде нескольких фракций, различающихся по заряду.
2. Были изучены физико-химические свойства кислых регуляторных белков. Показано, что они представляют собой низкомолекулярные белки, во вторичной структуре которых преобладают Я-структуры и статистический клубок; в водных растворах регуляторные белки образуют наноразмерные частицы в диапазоне 30-100 нм.
3. Методами иммуногистохимии в ткани печени позвоночных животных изучена локализация 2-х регуляторных белков, выделенных, соответственно, из печени и сыворотки крови млекопитающих. Впервые показано, что регуляторный белок печени локализуется в области синусоида, а слабокислый регуляторный белок - в межгепатоцитарном пространстве.
4. Разработана экспериментальная модель для изучения специфической биологической активности регуляторных белков млекопитающих - роллерная органная культура ткани печени тритона in vitro.
5. Показано специфическое действие регуляторных белков печени, сыворотки крови и желчи: регуляторный белок печени способствовал увеличению площади кластеров пигментированных клеток печени, но в тоже время угнетал пролиферативную активность соединительно-тканных клеток в краевой зоне, по сравнению с контролем; регуляторный белок сыворотки крови стимулировал пролиферацию соединительно-тканных клеток в краевой зоне, но способствовал уменьшению площади кластеров пигментированных клеток печени тритона, по сравнению с контролем; при добавлении регуляторного белка желчи наблюдали уменьшение площади кластеров пигментированных клеток и угнетение пролиферативной активности соединительно-тканных клеток в краевой зоне, по сравнению с контролем.
регуляторный белок печень тритон
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Борисенко А.В., Ямскова В.П., Благодатских И.В., Березин Б.Б., Краюхина М.А., Ямсков И.А. Идентификация регуляторных белков, биологически активных в сверхмалых дозах, и исследование их физико-химических свойств // Биологические мембраны. 2007. том 24. №3. С. 227- 233.
2. A.V. Borisenko, V.P. Yamskova, M.S. Krasnov, I.V. Blagodatskikh, V.V. Vecherkin, I.A. Yamskov “Regulatory proteins from the mammalian liver that display biological activity at ultra low doses” pp. 35-45 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. Р. 160. 2007.
3. V.P. Yamskova, M.S. Krasnov, E.Yu. Rybakova, V.V. Vecherkin, A.V. Borisenko, I.A. Yamskov “Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 2. Tissue localization and role in wound healing”, pp. 61-70 // In the book “Biochemical Physics Frontal Research”, Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov, Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. Р. 160. 2007.
4. Борисенко А.В., Ямскова В.П., Краснов М.С., Вечеркин В.В., Ямсков И.А. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из печени млекопитающих // В кн.: труды V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН- ВУЗЫ. Москва. 2005. С. 153-165.
5. Борисенко А.В. Изучение тканевой специфичности биологической активности регуляторных белков // Онтогенез. 2005. том 36. №3. С. 230-231.
6. Борисенко А.В. Влияние регуляторного белка, выделенного из печени крыс, на состояние ткани печени тритона Pleurodeles waltl при органном культивировании in vitro // Сборник тезисов «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты».2005. С. 17-18.
7. Борисенко А.В. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих // Сборник тезисов «Новые лекарственные средства. Успехи и перспективы» 2005. С. 110-111.
8. Борисенко А.В., Благодатских И.В., Березин Б.Б., Краюхина М.А., Липницкий Е.М., Лычников Д.С., Рубашникова Е.В., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные пептиды, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих // Сборник тезисов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб. 2006. С. 70.
9. Борисенко А.В. Исследование регуляторных белков, выделенных из печени млекопитающих: идентификация в ткани, исследование физико-химических свойств и биологического действия // Онтогенез. 2006. том 37. №.6 С. 311-312.