С целью определения уровня поглощения веществами, имеющими среднюю молекулярную массу на различных длинах волн, было проведено исследование супернатантов в диапазоне длин волн от 220 до 300 нм с указанным нижу интервалом.
В результате исследования получены данные, свидетельствующие о том, что максимальное отличие уровня поглощения света среднемолекулярными соединениями при смерти от отравления наркотическими веществами и от ишемической болезни сердца приходится на диапазон длин волн 235-280 нм.
Учитывая известную оптическую плотность интересующих нас среднемолекулярных пептидов, основные исследования осуществлялись в пределах 235 - 280 нм. Регистрация спектра в данной зоне ультрафиолетовой области спектра позволяет произвести комплексную оценку влияния на спектральную характеристику среднемолекулярных пептидов токсичных продуктов и более 200 наименований веществ, образующихся при нормальном и нарушенном метаболизме СМП. Измерения проводились на спектрофотометре в УФ спектре при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254 нм и 260 нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах, количественно равных показателям экстинкции.
- инфракрасная спектроскопия сухого остатка ликвора.
С целью определения химических соединений, входящих в состав подготовленного по вышеизложенной методике ликвора, проведено инфракрасное спектроскопическое исследование сухого остатка ликвора. Всего произведено исследование 18 спектрограмм, из них:
- 6 контрольных спектрограмм органических веществ: антифриза, цикламата натрия и клетчатки, сухого остатка ликвора человека, не имеющего в анамнезе употребление наркотических веществ и не страдающего сердечно-сосудистыми заболеваниями;
- 6 спектрограмм сухого остатка ликвора лиц, умерших от отравления наркотическими веществами;
- 6 спектрограмм ликвора лиц, умерших от заболевания сердечно-сосудистой системы.
Исследование произведено методом ИК-спектроскопии на приборе «Perkin-Elmer Spectrum One», с рабочим диапазоном до 1 до 25 мкм. Метод основан на способности органических веществ поглощать колебательную энергию именно в этом диапазоне. В инфракрасном спектрометре инфракрасное излучение расщепляется на два луча, один из которых проходит через исследуемый образец, а другой является стандартом для сравнения. Затем с помощью электронных устройств сравниваются интенсивности двух лучей и на ленте самописца регистрируется зависимость относительной интенсивности света, прошедшего через исследуемый образец, от длины волны (волнового числа). На ИК -спектрометре применяется диаграммная лента, градуированная как в единицах длин волн, так и в единицах волновых чисел, однако при обсуждении полученных данных обычно используют шкалу волновых чисел (в см-1), поскольку в таком случае удобнее связывать основные колебательные моды с соответствующими обертонами, а также полосы поглощения в ИК-спектрах и в спектрах комбинационного рассеивания. Подготовка образцов для исследования производится с помощью кювет, изготовленных из хлорида натрия, в которые помещаются образцы исследования в виде тонкой таблетки, спрессованной из тщательно перемешанных порошков исследуемого вещества и бромида калия. Подготовленный образец помещают непосредственно на пути луча в спектрометре.
Идентификация спектров проводилась в соответствии с имеющимся собственным каталогом известных химических соединений. Следует отметить, что по литературным данным и в наших экспериментах наличие изолированной функциональной группы или сочетания нескольких функциональных групп в одной молекуле обусловливает появление характерных полос поглощения, благодаря чему их можно идентифицировать в спектры неизвестного соединения (Крищенко В.П., 1987) .
В соответствии с техническими возможностями прибора и используемой в компьютерной программе базой данных при спектроскопии сухого остатка ликвора выявлены волновые числа, которые соответствуют валентным колебаниям алканов и алкилированных соединений, алкенам и алкенильным производным, ароматическим соединениям, ароматическим гетероциклическим соединениям, аминам, амидам, карбоновым кислотам и их солям, аминокислотам, простым эфирам, нитро- и нитрозосоединениям, то есть тем химическим группам, которые относятся к группе веществ, обладающих средней молекулярной массой.
Следует отметить, что база данных (библиотека) органических химических соединений, заложенная в использованном нами приборе, отмечалась небольшим количеством исследованных веществ, что позволяет говорить о далеко не полном перечне химических соединений, присутствующих во всех представленных спектрограммах.
- Метод унифицированной фиксации исследуемых показателей применялся путем заполнения единых кодификаторов, специально разработанных для однократного и серийного исследования ликвора Проведено исследование 163 порций ликвора от 95 трупов лиц, умерших в течение 2004 года от отравления наркотическими веществами и болезней системы кровообращения. При этом, в 80 случаях исследовались однократные порции ликвора, а в 15 случаях (83 порции ликвора) исследования проводились серийно, путем ежечасного забора ликвора.
- Математическая обработка.
Формирование базы данных, предваряющее процесс их обработки, осуществлялось с помощью программы электронных таблиц Microsoft Excel. В ней были сформированы несколько таблиц соответственно исследованным группам. Анализ полученных результатов осуществлялся в соответствии с правилами принятыми для медицинской статистики (Елисеева И.И., Юзбашев М.М., 1996; Айвазян С.А., Мхитарян В.С., 1998). При обработке полученных в ходе исследования данных, использовались компьютерные программы «Windows -98», «Microsoft Word -7.0а», «Microsoft Exel-7.0a», «Microsoft Access-7.0» на ПЭВМ Pentium - III с оперативной памятью 256 Мб и принтером «Hewlett Packar laserJet 1200 Series».
Формирование групп исследования производили с учетом следующих требований:
- обстоятельства смерти и давность ее возникновения были точно установлены следственным путем;
- исследовались трупы лиц, находящихся в холодильной камере морга при температуре +2 - +4 градуса С от 2,5 до 48 часов после наступления смерти;
- забор ликвора осуществлялся методом субокципитальной пункции;
- причина смерти подтверждалась патоморфологическими данными и результатами судебно-химических исследований.
Основную группу исследования составили 55 случаев смерти (83 порции ликвора) от отравления наркотическими веществами. Группу сравнения составили 40 случая смерти (80 порций ликвора) от болезней системы кровообращения.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В результате работы, направленной на изучение диагностической значимости среднемолекулярных соединений в ликворе лиц, умерших от отравления наркотическими веществами в основной группе, включающей 55 случаев (49 мужчин - 89,1% и 6 женщин - 10,9%), установлены определенные закономерности, выражающиеся в высоком уровне содержания СМ в ликворе и постепенном увеличении его с течением времени после наступления смерти.
При исследовании диагностических возможностей показателей уровня среднемолекулярных соединений в ликворе в группе лиц, умерших от болезней системы кровообращения (группа сравнения), включающей 40 случаев (27 мужчин - 67,5% и 13 женщин - 32,5%), установлены определенные закономерности, выражающиеся в более низком уровне содержания СМ в ликворе и постепенном увеличении его с течением времени после наступления смерти.
При длине волны 254 нм уровень среднемолекулярных соединений в ликворе при смерти от отравления наркотическими веществами колебался в пределах от 0,68 до 1,76 условных единиц оптической плотности, при выраженной зависимости от давности наступления смерти, которая колебалась от 6 до 45 часов. Самый низкий показатель уровня среднемолекулярных соединений отмечался у лиц, у которых забор ликвора совершался через 6 часов после смерти (0,68 - 0,69 ед.опт.плотности - 7 случаев), а наиболее высокие показатели уровня среднемолекулярных соединений в указанной группе отмечались при давности смерти 45 часов до момента забора ликвора у лиц, (1,76 единиц оптической плотности - 1 случай).
В группе сравнения, при длине волны 254 нм уровень среднемолекулярных соединений в ликворе в группе сравнения колебался в пределах от 0,54 до 0,77 условных единиц оптической плотности, при выраженной зависимости от давности наступления смерти, которая колебалась от 3 до 18 часов. Самый низкий показатель уровня среднемолекулярных соединений отмечался в ликворе лиц, умерших от острой формы ишемической болезни сердца (0,54 ед.опт.плотности при давности наступления смерти в течение 3 часов до момента забора ликвора) и от тромбофлебита нижних конечностей, осложнившегося тромбоэмболией легочной артерии (0,55 ед.опт.плотности при давности наступления смерти в течение 3 часов до момента забора ликвора). Наиболее высокие показатели уровня среднемолекулярных соединений в группе сравнения при длине волны 254 нм отмечались при давности смерти 18 часов до момента забора ликвора у лиц, умерших от острой формы ишемической болезни сердца (0,76-0,77 единиц оптической плотности - 3 случая) и от хронической ишемической болезни сердца (0,76-0,77 единиц оптической плотности - 2 случая).
Вычисление средних значений уровня СМ на различных сроках ДНС представлено на рис. 1.
Рис. 1. Средние значения уровня СМ в зависимости от давности смерти (254 нм)
При длине волны 260нм уровень среднемолекулярных соединений в ликворе при смерти от отравления наркотическими веществами колебался в пределах от 0,40 - 0,41 до 1,26 условных единиц оптической плотности, при выраженной зависимости от давности наступления смерти, которая колебалась от 6 до 45 часов. В указанной группе самый низкий показатель уровня среднемолекулярных соединений отмечался у лиц, ликвор которых забирался в течение 6 часов после наступления смерти (0,40 - 0,41 ед.опт.плотности - 7 случаев), а наиболее высокие показатели уровня среднемолекулярных соединений в этой группе отмечались при давности смерти 45 часов до момента забора ликвора у лиц, (1,26 единиц оптической плотности - 1 случай)
При длине волны 260нм уровень среднемолекулярных соединений в ликворе в группе сравнения колебался в пределах от 0,39 до 0,60 условных единиц оптической плотности, при выраженной зависимости от давности наступления смерти, которая колебалась от 3 до 18 часов. Самый низкий показатель уровня среднемолекулярных соединений отмечался в ликворе лиц, умерших от острой формы ишемической болезни сердца (0,39 ед.опт.плотности при давности наступления смерти в течение 3 часов до момента забора ликвора) и от тромбофлебита нижних конечностей, осложнившегося тромбоэмболией легочной артерии (0,40 ед.опт.плотности при давности наступления смерти в течение 3 часов до момента забора ликвора). Наиболее высокие показатели уровня среднемолекулярных соединений в группе сравнения при длине волны 260 нм, отмечались при давности смерти 18 часов до момента забора ликвора у лиц, умерших от острой формы ишемической болезни сердца (0,60 единиц оптической плотности - 2 случая) и от хронической ишемической болезни сердца (0,60 единиц оптической плотности - 2 случая).
Вычисление средних значений уровня СМ на различных сроках ДНС представлено на рис.2.
Рис. 2. Средние значения уровня СМ в зависимости от давности смерти (260 нм)
При длине волны 280нм уровень среднемолекулярных соединений в ликворе при смерти от отравления наркотическими веществами колебался в пределах от 0,07-0,08 до 0,71 условных единиц оптической плотности, при выраженной зависимости от давности наступления смерти, которая колебалась от 6 до 45 часов. Самый низкий показатель уровня среднемолекулярных соединений при этой длине волны (0,07 - 0,08 ед.опт.плотности) отмечался при давности наступления смерти в течение 6 часов до момента забора ликвора (7 случаев), а наиболее высокие показатели уровня среднемолекулярных соединений в группе сравнения отмечались при давности смерти 45 часов до момента забора ликвора (0,71 единиц оптической плотности - 1 случай).
При длине волны 280нм уровень среднемолекулярных соединений в ликворе в группе сравнения колебался в пределах от 0,06-0,07 до 0,27 условных единиц оптической плотности, при выраженной зависимости от давности наступления смерти, которая колебалась от 3 до 18 часов. Самый низкий показатель уровня среднемолекулярных соединений при длине волны 280 нм отмечался в ликворе лиц, умерших от острой формы ишемической болезни сердца (0,07 ед.опт.плотности при давности наступления смерти в течение 3 часов до момента забора ликвора) и от тромбофлебита нижних конечностей, осложнившегося тромбоэмболией легочной артерии (0,06 ед.опт.плотности при давности наступления смерти в течение 3 часов до момента забора ликвора). Наиболее высокие показатели уровня среднемолекулярных соединений в группе сравнения при длине волны 280нм отмечались при давности смерти 18 часов до момента забора ликвора у лиц, умерших от острой и хронической формы ишемической болезни сердца (0,27 единиц оптической плотности - 3 случая).
Вычисление средних значений уровня СМ на различных сроках ДНС показано на рис.3
Рис. 3. Средние значения уровня СМ в зависимости от давности смерти
Математический анализ полученных результатов показал их достаточно высокую точность, с ошибкой достоверности не больше 5%, что позволяет рекомендовать их к применению в судебно-медицинской практике.
Вышеуказанные закономерности изменения уровня СМ в ликворе лиц, умерших от отравления наркотическими веществами и умерших от болезней системы кровообращения при всех исследованных длинах волн, представлены на диаграммах 1 и 2.
Диаграмма № 1. Изменения уровня СМ в ликворе лиц, умерших от отравления наркотическими веществами.
Диаграмма № 2. Изменения уровня СМ в ликворе лиц, умерших от болезней системы кровообращения.
ВЫВОДЫ
1. Данные, полученные в работе, позволили определить показатели уровня среднемолекулярных соединений в ликворе при отравлении наркотическим веществами и смерти от заболеваний органов кровообращения при длине волны 254 нм, 260 нм и 280 нм, что позволяет использовать их в качестве дополнительных диагностических критериев.
2. Показатели уровня среднемолекулярных соединений в ликворе в случаях смерти от отравления наркотическими веществами характеризуются достоверно высокими цифрами (Р>0,95), и составляют при длине волны 254 нм 0,68 - 1,76 ед. опт. плотности; при длине волны 260 нм - 0,40 - 1,26 ед. опт. плотности и при длине волны 280 нм - 0,07 - 0,71 ед. опт. плотности.
3. Показатели уровня среднемолекулярных соединений в ликворе лиц, умерших от заболеваний сердечно-сосудистой системы ниже, чем в основной группе и составляют для длины волны в 254 нм - 0,54-0,77 ед. опт. плотности, для длины волны в 260 нм - 0,39-0,60 ед. опт. плотности, для длины волны в 280 нм - 0,06-0,27 ед. опт. плотности.