1. Макроскопический анализ листьев.
2. Макроскопический анализ травы.
3. Макроскопический анализ плодов и семян.
4. Макроскопический анализ коры.
5. Макроскопический анализ подземных органов.
6. Микроскопический анализ листьев.
7. Микроскопический анализ травы.
8. Микроскопический анализ плодов.
9. Микроскопический анализ семян.
10. Микроскопический анализ подземных органов.
11. Микроскопический анализ коры.
12 Физико-химические методы анализа биологически активных веществ лекарственного растительного сырья.
Современные физико-химические методы анализа имеют ряд преимуществ перед классическими химическими методами. На сегодняшний день существует большое количество аналитических приборов, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами и позволяющих анализировать практически любые органические соединения, содержащиеся в природных объектах. Они отличаются избирательностью, высокой чувствительностью, высокой степенью автоматизации.
К наиболее широко распространённым в настоящее время современным методам анализа растительного сырья относятся хроматографические методы и методы фотометрического анализа. Важнейшей особенностью этих методов является объективность оценки количественного содержания фармакологически активных веществ, что, в свою очередь, определяет качество растительного сырья.
Хроматографические методы анализа используются для разделения смеси веществ или частиц (например, ионов) и основаны на различии в скорости их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Поэтому хроматография применяется как на этапе пробоподготовки (очистки анализируемого компонента или смеси компонентов от сопутствующих примесей), так и в ходе непосредственного качественного и количественного анализов. При этом идентификация компонентов проводится по параметрам их удерживания в сравнении со стандартными образцами (свидетелями). Определение содержания искомых соединений или их групп в исходной смеси после хроматографического разделения проводится другими физико-химическими методами в зависимости от способа детекции.
По механизму разделения различают следующие виды хроматографии, применяемые в анализе лекарственного растительного сырья.
Адсорбционная хроматография, в основе которой лежит непрерывный обмен хроматографируемым веществом между неподвижной (твёрдой или жидкой) и подвижной фазами, обусловленный существованием на поверхности раздела фаз динамического равновесия между процессами адсорбции и десорбции хроматографируемого вещества, растворённого в подвижной фазе.
Распределительная хроматография, в основе которой лежит процесс непрерывного перераспределения хроматографируемого вещества между подвижной и неподвижной фазами, причём это вещество растворимо в каждой из фаз.
Ионообменная хроматография, в основе которой лежит обратимая хемосорбция ионов анализируемого раствора ионогенными группами сорбента. В зависимости от характера ионогенных групп ионообменные сорбенты (иониты) подразделяются на катионообменные (катиониты) и анионообменные (аниониты). Ионообменная хроматография в современном фармакогностическом анализе применяется весьма ограниченно, главным образом для очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей.
В анализе лекарственного растительного сырья применяется несколько методов хроматографического разделения, подразумевающих соответствующее аппаратурное оформление.
Адсорбционная хроматография на колонкахиспользуется главным образом для очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей. Классическая хроматографическая колонка представляет собой стеклянную трубку, заполненную сорбентом. Для разделения и очистки соединений растительного происхождения чаще всего используют полиамидный сорбент и силикагель, реже применяют колоночную хроматографию на сефадексе и алюминия оксиде. Так, очистку суммы флавоноидов травы сушеницы топяной и плодов боярышника, суммы ксантонов в траве золототысячника проводят с помощью адсорбционной хроматографии на полиамидном сорбенте. Затем в полученном элюате спектрофотометрическим методом определяют содержание действующих веществ.
Как вариант адсорбционной и/или распределительной колоночной хроматографии для очистки многокомпонентных смесей растительного происхождения в последнее время всё чаще применяется метод твёрдо-фазной экстракции (ТФЭ). ТФЭ отличается от классической колоночной хроматографии прежде всего принудительной подачей элюента под действием вакуума на выходе из хроматографической системы. Для получения разрежения определенной величины используют специальное герметичное устройство-приёмник (манифолд), в верхней части которого крепятся хроматографические «колонки» (патроны и/или картриджи), а к нижней подключен вакуум-насос с электроприводом. На мировом рынке системы для ТФЭ предлагаются фирмой «Supelco» (США).
Тонкослойная хроматография, или ТСХ (адсорбционная хроматография в тонком слое сорбента), чаще всего применяется при качественном анализе лекарственного растительного сырья или на стадии пробоподготовки для очистки анализируемых компонентов.
Используют хроматографические пластины с закреплённым или незакрепленным слоем сорбента. Наиболее распространены сорбенты на основе силикагеля, реже применяют алюминия оксид, целлюлозу или полиамидный сорбент. Качественный анализ компонентов лекарственного растительного сырья с применением ТСХ проводят путём детекции невооруженным глазом флуоресценции или окраски пятен в УФ и видимом свете при сравнении со свидетелями. Основным параметром при этом, наряду с характерным окрашиванием или флуоресценцией пятен, является относительное удерживание компонентов, или Rf. Использование метода ТСХ на стадии пробоподготовки в количественном анализе лекарственного растительного сырья предусматривает элюирование действующих веществ с хроматографической пластины и последующий анализ элюата другими методами. Например, разделение суммы флавоноидов цветков боярышника проводят на пластинах «Силуфол» или «Сорбфил», после чего пятно гиперозида элюируют с пластины, а его содержание в элюате определяют спектрофотометрическим методом.
В последнее время активно развивается метод количественной ТСХ с использованием специального прибора — денситометра, работа которого основана на измерении плотности флуоресценции или окраски пятна анализируемого компонента непосредственно на пластине. Для этого денситометр снабжён цифровой видеокамерой или сканером, а обработка полученных результатов производится с помощью специальной программы на компьютере. Применение денситометрии позволяет проводить экспресс-анализ компонентов сырья без их элюирования с пластины. Производство денситометров активно развивается как в России, так и за рубежом. На российском рынке в настоящее время представлена продукция отечественного производителя «ЛенХром», Санкт-Петербург (денситометр «ДенСкан») и швейцарской фирмы «Camag» (спектро-денситометр «САМAGScanner3»).
Использование хроматографии на бумаге (БХ), имеющей как распределительный, так и адсорбционный механизмы разделения компонентов, в настоящее время ограничено и применяется для качественного анализа лекарственного растительного сырья. По способу перемещения подвижной фазы различают восходящую, нисходящую и круговую БХ. Детекцию осуществляют сходным с ТСХ образом. Так, качественный анализ флавонолов листьев вахты трёхлистной проводят с помощью восходящей БХ с последующим проявлением хроматограммы раствором алюминия хлорида.
В самом общем виде все перечисленные методы хроматографии не требуют специального аппаратурного оформления, за исключением количественной ТСХ и твёрдо-фазной экстракции. К строго приборным методам хроматографического анализа относятся газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография.
Газовая хроматография(ГХ) — это хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара. В фармацевтическом анализе находят применение газожидкостная (ГЖХ) и газоадсорбционная хроматографии. В газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесённая на твёрдый носитель, т.е. используется распределительный механизм разделения компонентов. В газоадсорбционной хроматографии неподвижной фазой является твёрдый адсорбент.
Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих веществ, в том числе компонентов эфирных масел, например ледола и палюстрола в эфирном масле побегов багульника болотного.
Также возможно проведение химической модификации (дериватизации) компонентов анализируемой смеси с целью получения летучих производных и их последующий анализ методом ГХ. В качестве примера газохроматографического анализа с использованием дериватизации можно привести анализ летучих производных карбоновых кислот и моносахаридов, в том числе и растительного происхождения.
Детектирование на выходе из газохроматографической системы производится несколькими способами. Наиболее часто применяют детекторы теплопроводности (ДТП, или катарометр) и пламенно-ионизационный (ПИД). Реже используют селективные детекторы, такие как электронно-захватный (ЭЗД) и термоионный (ТИД).
На базе колоночной хроматографии возникла высокоэффективная жидкостная хроматография(ВЭЖХ). От классической колоночной хроматографии ВЭЖХ отличается использованием сорбентов с размером частиц 3-10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделения. Для обеспечения беспрепятственного прохождения элюента через колонку с ультрамелким сорбентом на входе в хроматографическую систему создается высокое давление. Поэтому другим названием ВЭЖХ является «жидкостная хроматография высокого давления».
Лидирующее положение занимает обращённо-фазовая ВЭЖХ, в которой используются сорбенты на основе силикагеля с привитыми на его поверхности молекулами неполярных соединений, таких как высокомолекулярные углеводороды, фенолы и их производные. При этом хроматографическое разделение происходит за счёт распределительного (главным образом) и адсорбционного (в меньшей степени) механизмов, детектирование в ВЭЖХ осуществляется с помощью фотометрических и электрохимических методов анализа. Основное значение имеет спектрофотометрическая детекция в УФ области.
Преимуществом ВЭЖХ (особенно обращённо-фазовой) перед газовой хроматографией является возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам. Поэтому подавляющее большинство действующих веществ лекарственного растительного сырья может быть проанализировано этим методом (рис. 5). В фармацевтическом анализе метод ВЭЖХ в настоящее время используется главным образом при анализе препаратов на основе лекарственного растительного сырья, такого как женьшень, родиола розовая, шиповник и др.
Метод ВЭЖХ широко представлен в фармакопеях Европы и США в фармстатьях на лекарственное растительное сырье.
Так, в соответствии с Европейской Фармакопеей стандартизацию корней женьшеня проводят путем определения суммы гинзенозидов Rb1 и Rg1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)]. Фармакопей США предложено определять содержание гинзенозидов Rb1 и Rg1 отдельно друг от друга, также используя метод ВЭЖХ.
Во всех зарубежных фармакопеях рекомендуется определять в ЛРС содержание арбутина или его производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В более ранних изданиях использовалось спектрофотометрическое определение содержания производных гидрохинона в пересчете на арбутин после реакции с аминопиразолоном, раствором аммиака и гексацианоферратом калия (III). По ГФ XI содержание арбутина определяется методом йодометрического титрования: данный метод длителен, трудоемок, поэтому данный раздел ФС также требует подбора альтернативного современного метода анализа.
Для проведения анализа методами ГЖХ и ВЭЖХ используются аналитические приборы — хроматографы. Количество отечественных и зарубежных фирм-производителей, выпускающих газовые и жидкостные хроматографы, неуклонно растёт, поэтому перечислим только некоторые из них. Из отечественных фирм-производителей устойчивую нишу на российском рынке занимают фирма «Аквилон», Москва (жидкостные хроматографы «Стайер»), ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск (микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02») и СКВ «Хроматэк», Йошкар-Ола (газовые хроматографы «Кристалл»). Огромный спектр продукции для ГХ и ВЭЖХ выпускается иностранными фирмами: «Agilenttechnologies», «HewlettPackard», «Waters», «Neolab» (США), «Shimadzu» (Япония-Германия), «Knauer» (Германия).
Фотометрические методы анализа основаны на поглощении электромагнитного излучения индивидуальным веществом или группой анализируемых веществ.
Наибольшее распространение в применении к фармакогностическому анализу получило электромагнитное излучение ультрафиолетового (УФ) и видимого (ВИД) диапазонов (обычно принято считать видимым излучение с длиной волны от 800 до 400 нм, а ультрафиолетовым — от 400 до 200 нм, длина волны меньше 200 нм — далекий УФ).
В зависимости от используемой аппаратуры, различают спектрофотометрический и фотоколориметрический анализ, к последнему близко примыкает колориметрический.
Спектрофотометрический анализ— анализ поглощения веществом монохроматического излучения с определённой длиной волны. Здесь выполняется основной закон поглощения — закон Бугера-Ламберта-Бэра:
где I0- интенсивность излучения, падающего на раствор; I- интенсивность излучения, прошедшего через раствор; c- концентрация вещества в растворе; b- толщина слоя, см; D- оптическая плотность; k- коэффициент поглощения вещества.
Этот вид анализа выполняется на спектрофотометрах ВИД и УФ диапазона (обычно 200-1100 нм). Регистрируется спектр поглощения (зависимость поглощенного излучения от длины волны) или часть спектра поглощения (отдельная полоса поглощения). Измерение оптической плотности производится на фиксированной длине волны (как правило, в максимуме полосы поглощения).
В настоящее время рынок выпускаемых фирмами-производителями спектрофотометров УФ и ВИД диапазона очень широк. Из отечественных приборов наиболее распространены спектрофотометры, выпускаемые фирмой «ЛОМО» (Санкт-Петербург) — «СФ-56», «СФ-2000/2001»; фирмой «Аквилон» (Москва) — «СФ-101», «СФ-103», «СФ-201». Из зарубежных — спектрофотометры фирмы «Shimadzu» (Япония) — «UVmini-1240», «UV-1700PharmaSpec», «UV-2401/2501PC», фирмы «AnalyticJena» (Германия) — «Specord-200», «Specord-50/40/30», «Specol1100/1200» и др.
Все выпускаемые приборы являются сканирующими, с автоматической записью спектра и управляются компьютерами или встроенными процессорами (для компактных моделей). Они оснащены разнообразными программными продуктами, позволяющими оперативно решать различные спектрофотометрические задачи. Разнообразие выпускаемых приборов определяется целями анализа — рутинный поточный анализ или решение сложных аналитических задач.
Фотоколориметрический анализ— анализ поглощения веществами немонохроматического излучения, которое получается с помощью светофильтров, выделяющих сравнительно узкий интервал длин волн (20-40 нм).
При фотоколориметрическом анализе закон Бугера-Ламберта-Бэра применим с большей или меньшей степенью приближения в зависимости от степени постоянства величины оптической плотности (D) в данном интервале длин волн.
Приборы, используемые для такого вида анализа, позволяют измерить оптическую плотность лишь в интервале длин, выделяемых светофильтрами. Для этих целей используются фотоэлектроколориметры различных типов (например, ФЭК или КФК).
Колориметрический анализ основан на сравнении интенсивностей окрасок растворов разных концентраций визуально или при помощи несложных приборов — колориметров.
Фотометрические измерения обычно проводят в водных или спиртовых растворах.
При анализе растительного сырья наиболее распространено количественное определение суммы действующих веществ в пересчёте на конкретное соединение, которое должно отвечать определённым требованиям: это соединение должно входить в состав суммы действующих веществ и для него должен существовать государственный стандартный образец (ГСО). Например, в траве зверобоя спектрофотометрически оценивается содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин. В случаях отсутствия ГСО, в качестве стандарта используют иное соединение, имеющее сходный с определяемым коэффициент поглощения на аналитической длине волны. Подобным приёмом пользуются при фотоколориметрическом определении суммы антраценпроизводных, где в качестве стандарта используют кобальта хлорид (кора крушины, корни ревеня и др.).
Определение концентрации веществ в растворе проводят тремя основными способами.
Первый способ основывается на измерении оптической плотности с последующим применением закона Бугера-Ламберта-Бэра для расчёта концентрации. Этот способ применим, когда известен коэффициент поглощения исследуемого вещества на данной длине волны. Таким образом определяют количественное содержание суммы антоцианов в пересчёте на цианидин-3,5-дигликозид в цветках василька синего.
Второй способ— определение концентрации исследуемого соединения путём сравнения величин оптических плотностей его раствора и раствора стандартного образца в известной концентрации. Так определяют содержание суммы флавоноидов в пересчёте на изосалипурпозид в цветках бессмертника песчаного.
Третий способ— построение калибровочного графика с использованием серии растворов стандартного образца известной концентрации, например количественное определение суммы флавоноидов в пересчёте на ононин в корнях стальника.
Современный фармакогностический анализ также предусматривает использование многих других физико-химических методов. При выделении из растений органических веществ, требующих идентификации и определения их количественного содержания, успешно используются такие методы, как поляриметрия, люминесцентный анализ, ИК-спектроскопия, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, хромато-масс-спектрометрия, электрохимические методы и др.
13 Понятие об эфирных маслах: Классификация эфирных масел и лекарственного растительного сырья. Способы получения эфирных масел. Пути использования сырья, медицинское применение. Особенности заготовки, сушки, хранения сырья ЛРС содержащего эфирные масла.
Эфирные масла— многокомпонентные смеси летучих органических соединений, которые образуются в растениях и обусловливают их запах.
Эфирные масла получили свое название потому, что имеют маслянистую консистенцию, на бумаге оставляют жирное пятно, исчезающее через некоторое время.
Мировая флора насчитывает около 3 тысяч видов растений-эфироносов,промышленное значение имеют 150—200 видов. Большинство из них произрастает в тропиках и субтропиках, некоторые (кориандр, анис, фенхель,мята перечная и др.) культивируются в средней полосе.
Зачастую эфирные масла накапливаются во всех органах растения, но количественное распределение их неодинаково, благодаря чему, в эфиромасличной промышленности значение имеют только те части растения, где содержание эфирного масла максимально. Большинство растений семейства губоцветных накапливают масла в листьях и соцветиях, зонтичных – в семенах. Ценные эфирные масла получают из кожуры цитрусовых. Из корней добывают эфирные масла ириса и аира. Из цветков, лепестков или соцветий – эфирные масла розы, жасмина, иланг-иланг, лаванды. Эфирные масла в растениях большей частью находятся в свободном состоянии, однако у некоторых растений они содержатся в форме гликозидов и освобождаются только в результате их ферментативного расщепления.
Значение эфирных масел для растения и закономерности его накопления в растении
Вопрос, каково же значение образующегося эфирного масла для самого растения долго оставался дискуссионным. Высказывалось несколько точек зрения:
Эфирные масла служат для защиты от болезней и вредителей
Запахи растений служат для привлечения насекомых
Испаряясь, эфирные масла регулируют транспирацию
Эфирные масла выполняют роль запасных веществ
Эфирные масла – продукты распада и отходы жизнедеятельности растения.
До настоящего времени этот вопрос не раскрыт полностью. С развитием более точных методов исследований стало очевидным, что эфирные масла являются активными участниками обменных процессов, происходящих в растительном организме. Накапливаясь в растении, по мере развития растения и выполнения той или иной физиологической функции эфирное масло претерпевает изменения в составе. Так, по мере созревания кориандра запах эфирного масла изменяется от неприятного “клоповного” до исключительно ароматного. При выращивании в Крыму розмарина отметили тот факт, что эфирное масло, на протяжении всего года сохраняющее правое вращение (эфирные масла являются оптически активными жидкостями) вдруг в течение апреля-мая начинает вращать плоскость поляризации влево. Изменения в составе эфирного масла происходят не только в течение года, но и в течение суток. Так, к примеру, соцветия лаванды для переработки собирают во второй половине дня, а лепестках розы больше всего эфирного масла накапливается ранним утром (4-6 ч.).
Получение.Эфирные масла получают методом перегонки с водяным паром (гидродистилляция); экстракциейорганическими растворителями, инертными сжиженными газами, жирным маслом (мацерация); методом поглощения твердым жиром (анфлераж); прессованием(из кожуры цитрусовых).
Выбор способа получения зависит от химического состава эфирного масла, морфолого-анатомических свойств сырья и от того, в какой отрасли масло будет использоваться. Для выделения эфирных масел используют свежесобранное, подвяленное, высушенное или предварительно ферментированное сырье. Медицинские масла получают перегонкой с водяным паром.