свойствами. Одним из представителей базидиальных грибов, пригодных в пищу и способных к синтезу каротиноидных пигментов, является Laetiporus sulphureus (Гвоздкова и др., 2003, 2008). Основой разработанной биологически активной добавки (БАД) «Летипорин» является субстанция, представляющая собой сухой порошкообразный мицелий красно-оранжевого цвета, полученный на основе базидиального гриба Laetiporus sulphureus (Гвоздкова и др., 2006). Носителем биологической активности мицелия гриба, по данным авторов разработки, является именно липокаротиноидный комплекс. L. sulphureus, кроме того, характеризуется наличием в глубинном мицелии целого ряда комплекса биологически активных липоидных соединений: полиеновых жирных кислот, стероидных соединений, фосфолипидов (Капитанов, Пименов, 1996; Дзыгун, Дудка, 2008). Действительно, в липидной части мицелия, составляющей 20–25% в расчете на сухое вещество (СВ), наиболее важными и физиологически активными компонентами являются полиеновые пигменты каротиноидной природы (0,8–1,0%), фосфолипиды (4–7%), стероидные соединения, в том числе, провитамин Д (более 1,0%) от воздуш- но-сухого мицелия и тритерпеновые кислоты. В составе липидов мицелия гриба L. sulphureus содержатся насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с четным числом атомов углерода (от 12 до 18). Из насыщенных жирных кислот преобладает пальмитиновая кислота (13–16% от общей суммы кислот). Более 65–70% приходится на долю линолевой кислоты. Липокаротиноидный комплекс мицелия гриба L. sulphureus характеризуется высокой антиокислительной активностью (70–90% от АОА ионола), которая обусловлена не только природой входящих в него компонентов, но и их синергическим взаимодействием (Гроздкова и др., 2006). В экспериментах in vivo установлен высокий потенциал антиоксидантного действия БАД «Летипорин», ее радио- и гепатопротекторные свойства. Способность к активному синтезу каротиноидов является индивидуальной особенностью данного вида, поскольку не известна у других видов базидиомицетов. Указаны антимикробные свойства мицелия и вытяжек из плодовых тел L. sulphureus (Тихонова и др., 2010). В базидиомах этого вида обнаружен холин, который входит в состав лецитинов и является метилирующим агентом в биологических процессах. При отсут-
65
ствии или недостатке холина в организме человека возрастает риск заболеваний печени. Кроме того, отмечено наличие в плодовых телах бетаина, гистидина, герцинина, производных имидазола, обладающих физиологической активностью (Шиврина, 1965). По данным А.Н. Шивриной и О.П. Низковской (1969), L. sulphureus активно синтезирует эргостерол, из которого в настоящее время биотехнологически осуществляется синтез кортизана – препарата гормона коры надпочечников, применяемого в медицине как противовоспалительное и противоревматическое средство (Озерова, 2006).
В последние годы резко возрос интерес исследователей и крупных фармацевтических компаний к высокомолекулярным пигментам фенольной природы – меланинам. Природные меланины характеризуются широким спектром фармакологического действия: антиоксидантным, гено- и радиопротекторным, иммуномодулирующим, гепатопротекторным. Эти пигменты используются как составляющая косметологических средств, обладающих фотопротекторной активностью, а также сорбентов радионуклидов и ионов тяжелых металлов. Возможности промышленного получения различных меланинов из природных источников весьма ограничены. Решением вопроса поиска альтернативных путей его получения может быть биотехнологический процесс направленного синтеза меланина с помощью грибовпродуцентов. В лаборатории экспериментальной микологии Института микробиологии НАН Белоруси проводятся исследования по выявлению активных продуцентов меланинов среди микро- и макромицетов. По представленным данным, среди макромицетов перспективны ксилотрофные базидиомицеты Inonotus obliquus и Phellinus robustus (Бабицкая и др., 2007). В исследова-
ниях авторы установили различия электронных спектров меланиновых комплексов, полученных из грибов различных таксономицеских групп. Показано, что экзо- и эндомеланины, продуцируемые макромицетами, являются меланопротеидами и незначительно отличаются между собой по физико-химическим свойствам. Их относят к пирокатехиновому типу. Авторами в серии экспериментов установлены антиоксидантные и генопротекторные свойства грибных меланинов, что свидетельствует о пер-
66
спективе их использования при создании антиканцерогенных препаратов.
По существующим оценкам в настоящее время около 3% населения планеты инфицировано вирусом гепатита С, при котором хронический гепатит формируется у 70–80% больных. Наиболее перспективным в лечении этой патологии отношении является Микотон – препарат из высших базидиальных грибов, обладающий всем спектром биологических активностей. Он представляет собой меланин-глюкан-хитиновый комплекс с сохраненной архитектоникой клеточной стенки грибов (Вовк и др.,
2006).
В Украине, на основе комплекса трутовых грибов, получен новый меланин-гликановый комплекс с высокой биологической активностью, который показал мощные генопротекторные свойства, позволяющие снизить повреждающие ДНК эффекты проникающей радиации, химических мутагенов (Сенюк и др., 2008). В экспериментах in vitro и в опытах с использованием лабораторных животных было показано, что данный препарат способен практически нивелировать эффекты хронического облучения в малых дозах и существенно облегчить последствия острого радиационного облучения на однонитевые разрывы ДНК.
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о широких перспективах использования ксилотрофных базидиомицетов в качестве источников лекарственных и профилактических соединений, биологически активных добавок к пище. В связи с этим, продолжает оставаться актуальным как поиск новых продуцентов, скрининг перспективных штаммов, идентификация действующих начал, так и исследование возможностей регуляции и интенсификации процессов синтеза.
1.4 Возможности регуляции развития культуры продуцента и ее биосинтетической активности
Последние несколько десятилетий активно ведутся глубокие исследования физиологии высших грибов и возможностей регуляции их развития. Требуют подробного изучения сложные физиологические и биохимические процессы, происходящие при росте и развитии грибного организма. Их интенсивность опреде-
67
ляется наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды (Сидоренко, Ефремова, 2008). При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид
иштамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и другие, необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов (Дворнина, 1990; Цивилева, 2008; Яценко, Бойко, 2010). Не менее важная задача – добиться управляемого биосинтеза как первичных, так
ивторичных продуктов метаболизма за счет использования лимитирующих факторов питания, существенно влияющих на синтез целевого продукта.
Практика производства метаболитов мицелиальных грибов имеет множество примеров использования таких возможностей. Поскольку базидиальные грибы в качестве продуцентов ценных метаболитов и активных начал имеют не столь значительную историю, вопросы регулируемого синтеза, а также управления развитием в их отношении находятся в активной разработке (Фомина и др., 1999; Цивилева и др., 2005). Для этой группы организмов в литературе указывается, что синтез вторичных метаболитов (ферментов, антибиотиков, каротиноидных и меланиновых пигментов) детерминирован не только генетически, но и в определенной мере зависит от внешних факторов, таких как источники углерода, азота и их соотношения, минеральных компонентов питательной среды, а также температуры, рН среды и интенсивности аэрации (Николайчук и др., 2005). В исследованиях, посвященных изучению факторов регуляции синтеза меланиновых пигментов штамма Inonotus obliquus проведен анализ действия ряда регулирующих рост и процессы метаболизма факторов (Щерба и др., 2007; Черноок и др, 2008). В качестве источников углерода для I. obliquus служили арабиноза, ксилоза, галактоза, глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, лактоза, целлобиоза, манит, сорбит, крахмал, ржаная мука, Na-янтарнокислый, щавелевокислый, малоновокислый. Максимальный выход меланина
(0,87г/л) наблюдался на среде, содержащей целлобиозу. I. obliquus также активно использовал глюкозу, арабинозу, ксило-
68
зу, маннит и сорбит, где выход меланина составил 0,60 – 0,65 г/л. То, что на среде с целлобиозой гриб синтезировал наибольшее количество пигмента, авторы объясняют аналогией с его питанием в природных условиях, где целлюлоза под действием гидролитических ферментов расщепляется до целлобиозы и используется как источник углерода. Исследование источников азотного питания показало, что минеральный азот не оказывал существенного влияния на синтез меланина I. obliquus, а среди органического азота лучшим оказался пептон. Из литературы известно, что внесение в среду культивирования ионов меди в определенной концентрации стимулирует рост грибов и синтез вторичных метаболитов. Проведенные исследования показали, что оптимальное содержание ионов меди для синтеза меланина составило 0,008%. Исследование влияния на меланиногенез ароматических соединений показало, что моноциклические добавки пирокатехин, тирозин, бензойная и пара-оксибензойная кислоты стимулируют синтез меланина, тогда как фенол и бициклическая добавка 2- нафтол, напротив, ингибируют его (Щерба и др., 2007).
На наш взгляд, огромное значение имеют и сами метаболиты, образуемые в процессе жизнедеятельности культуры. С этих позиций, для выбора оптимальной технологии культивирования с учетом использования регуляторных приемов, нужно, прежде всего, учитывать особенности различных этапов развития культуры. Известно, что рост микроорганизмов можно охарактеризовать как S - образную кривую. За фазой адаптации (лаг-фазой) следует первая стадия - стадия быстрого роста, или логарифмическая, для которой характерен синтез первичных метаболитов. Далее наступает фаза медленного (стационарного) роста, когда увеличение биомассы клеток резко замедляется. Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию быстрого роста, трофофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу; именно в этот период синтезируются идиолиты. Считается, что они вырабатываются клетками для адаптации к условиям окружающей среды, например, для защиты. Идиолиты, или вторичные метаболиты, не играют явной роли, однако могут играть кос-
69