На первых базовых моделях, было установлено дозозависимое иммунотропное действие большинства ядов белковой природы активно-ядовитых животных. Поэтому, исследование изменений интенсивности процессов ПОЛ и фагоцитарной активности клеток крови проводили в условиях воздействия ядами вооруженных активно-ядовитых животных. Был использован яд пчелы медоносной - Apis mellifera L. и змеиные яды: гюрзы среднеазиатской - Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной - Echis carinatus Schneid., сем.Viperidae; кобры среднеазиатской - Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae.
Хемилюминесцентная (ХЛ) кривая фагоцитирующих клеток периферической крови контрольных проб имела относительно пологую фазу роста и характеризовалась тремя пиками активности: собственным (5-7 мин), опсоническим (12-15 мин) и суммарным (19-20мин). Максимальная хемилюминесценция клеток крови контроля составляла 0,179 мВ на 19 мин фагоцитарного ответа. Светосумма ХЛ сигнала у контрольного образца равнялась 88,41 мВ. Иной характер имели кривые ХЛ-ответа опытных проб (рис.13).
Рис. 13. Интенсивность хемилюминесцентного ответа фагоцитарных клеток крови при действии змеиными ядами. По оси ординат - интенсивность хемилюминесценции (мВ).
Показано, что яд эфы практически сразу же после внесения в пробу резко угнетал процесс фагоцитоза. Светосумма ХЛ ответа под действием яда эфы значительно уменьшалась и составляла 43,68 мВ. Яд гюрзы, напротив, вызывал значительное усиление фагоцитарной активности, превышая более чем в два раза значение контроля (0,179 мВ) до 0,395 мВ на 9 мин фагоцитоза. В динамике развития фагоцитоза, как известно, выделяют несколько стадий (Маянский А.М., Маянский Д.М., 1989). Можно полагать, что активация процесса фагоцитоза ядом гюрзы происходила за счет более быстрого включения иммуноглобулинов, обладающих опсонизирующей активностью для нейтрофилов. Напротив, яд эфы снижал резервные возможности активированных клеток.
Супрессорное действие яда эфы проявлялось в начальной внеклеточной фазе фагоцитоза и препятствовало контакту модельных антигенов с рецепторами нейтрофилов и активации мембранных механизмов клеток. Оценка действия змеиных ядов на ПОЛ эритроцитарных мембран свидетельствовала о разной степени нарушений в системе окислительного метаболизма эритроцитов (табл. 3). Яд эфы, в обеих концентрациях, не оказывал существенного влияния на кинетику ХЛ-ответа и не вызывал изменения интенсивности свечения по сравнению с контрольным образцом. Интенсивность сигнала при инкубации эритроцитов с ядом гюрзы (100 мкг) снижалась на 13% по сравнению с контролем.
Таблица 3 Изменение антиокислительной активности липидов клеточных мембран под действием зоотоксинов
|
Образец яда |
Кол-во в пробе, мкг |
Средняя интенсивность биохемилюминесценции, мВ |
Уровень значимости, р |
|
|
Контроль |
0,49±0,008 |
|||
|
Яд эфы песчаной |
50 |
0,49±0,03 |
0,920 |
|
|
100 |
0,48±0,01 |
0,454 |
||
|
Яд гюрзы среднеазиатской |
50 |
0,45±0,03 |
0,169 |
|
|
100 |
0,42±0,03 |
0,031 |
||
|
Яд кобры среднеазиатской |
50 |
0,50±0,006 |
0,407 |
|
|
100 |
0,86±0,04 |
0,001 |
||
|
Яд пчелы медоносной |
1,0 |
0,79±0,03 |
<0,001 |
|
|
2,5 |
0,88±0,02 |
<0,001 |
Яд кобры (100 мкг) приводил к значительному увеличению интенсивности ХЛ до 175 % по отношению к контролю. Пчелиный яд, характеризующийся высокой гемолитической активностью (Habermann, 1972), в концентрациях 1,0 и 2,5 мкг (не вызывающих видимого гемолиза клеток с эритроцитарной массой), приводил к интенсификации ПОЛ. С определенной уверенностью можно полагать, что модуляция окислительного метаболизма клеток находится в тесной зависимости с их гемолитической активностью. По суммарному воздействию на свободно-радикальные процессы исследованные яды могут быть расположены в убывающей по силе воздействия последовательности: пчелиный яд > яд кобры среднеазиатской > яд гюрзы среднеазиатской. Модулирующее действие исследованных ядов в отношении перекисного окисления (ПОЛ) клеточных мембран связано с непосредственным воздействием их гемолизирующих составляющих (цитотоксинов) на рецепторы цитоплазматических мембран.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о модуляции ядами активно-ядовитых животных фагоцитарной активности и ПОЛ клеток крови, связанной с непосредственным воздействием их гемолизирующих составляющих на рецепторы цитоплазматических мембран. Перекисное окисление липидов стимулируется белковыми ядами активно-ядовитых животных, независимо их таксономической принадлежности (ядами пчелы и кобры), при условии содержания в них цитотоксинов.
7. Иммуногематологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях антропогенного средового стресса
Важной составляющей химической коммуникативной системы являются взаимодействия между организмами (популяциями, сообществами) и средой обитания. Изучение компенсаторных иммунных реакций позволяет понять физиологические механизмы, благодаря которым организмы выживают и приспосабливаются к изменяющимся условиям существования. В этой связи весьма важна оценка состояния популяции, для получения которой использовали комплекс показателей гомеостаза: уровень стабильности развития и иммунного статуса организма индикаторного вида амфибий (Захаров и др., 2000; Захаров, Крысанов, Пронин, 2007).
7.1 Оценка качества среды обитания по величине флуктуирующей асимметрии меристических признаков популяций лягушек рода Rana
Для оценки качества среды за период с 2000 по 2006 г была проведена биоиндикация водоемов, расположенных в заречной части г. Нижнего Новгорода (8 водоемов) и Нижегородской области (7 водоемов) по стабильности развития популяций зеленых лягушек рода Rana, оцениваемой по величине флуктуирующей асимметрии (ФА) (n=970). В результате были получены значения величин ФА, основанные на традиционном, разностном методе вычисления (Методические рекомендации…, 2003), по комплексу из 11 стационарных признаков окраски для зеленых лягушек (Захаров, Чубинишвили, 2001). Показано, что популяции амфибий урбанизированных территорий характеризовались возрастанием величины интегрального показателя. Методами непараметрической (критерий Крускалла-Уоллеса) обоснована правомерность распределения исследованных популяций животных на пять объединенных групп в соответствии с пятибалльной шкалой качества среды. В качестве интегральной характеристики применили среднюю взвешенную величину ФА (Гелашвили и др., 2001), имеющую наименьшую дисперсию среди линейных оценок (Ивантер, Коросов, 1992), рассчитанную для каждого балла качества среды обитания с учетом численности объединенной группы (табл. 4). Полученные величины ФА для каждого балла, установленные с учетом доверительного интервала (X mt), не выходили за границы нормативных значений, соответствующих «Методическим рекомендациям.., 2003».
Таблица 4 Качество среды обитания в водоемах г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области, оцениваемое по средней взвешенной величине ФА популяций зеленых лягушек рода Rana
|
Обобщенная группа |
Качество среды обитания |
Число водоемов |
Годы исследования |
Значение средней взвешенной ФА (Мвзвm) |
|
|
1 |
I балл - условно-нормальное |
3 |
2000,2003, 2004,2005 |
0,450,0014 |
|
|
2 |
II балл -начальные (незначительные) отклонения от нормы |
6 |
2000,2001, 2002,2005,2006 |
0,510,0006 |
|
|
3 |
III балл - средний уровень отклонения от нормы |
4 |
2000,2001, 2003,2006 |
0,570,0014 |
|
|
4 |
IV балл - существенные (значительные) отклонения от нормы |
5 |
2002,2003, 2004,2005,2006 |
0,620,0007 |
|
|
5 |
V балл - критическое состояние |
4 |
2002,2003, 2004,2005 |
0,670,0015 |
Таким образом, полученные значения величин ФА для популяций зеленых лягушек г. Нижнего Новгорода и Нижегородской обл., позволили провести оценку качества среды обитания согласно нормативной документации и распределить исследованные популяции животных на пять объединенных групп, в соответствии с пятибалльной шкалой оценки изменения состояния организма по уровню стабильности. Оценку иммунного гомеостаза организма амфибий проводили путем определения лейкоцитарной формулы крови, количества Т- и В-лимфоцитов, фагоцитирующих нейтрофилов в крови, тимусе и селезенке, индекса лимфоидных органов.
7.2 Количественная и качественная характеристика лейкоцитарного состава периферической крови амфибий урбанизированной среды
Снижение общей доли лейкоцитов в периферической крови характерно для всех популяций лягушек, обитающих в водоемах с высоким прессом антропогенной нагрузки (II - V балл качества среды)(15 водоемов г. Нижнего Новгорода и Нижегородской обл.), при этом установлена отрицательная корреляция величины ФА и общего числа лейкоцитов в периферической крови лягушек. Уравнение регрессии, аппроксимирующее линейную зависимость данных показателей имеет вид: (R2 = 0,65; r=0,80;p<0,001) (рис.14). Результат анализа зависимости, как по первичным экспериментальным данным, так и по средневзвешенным величинам, показал, что примерно на 65% (показатель детерминации R2=0,65), дисперсия показателя лейкоцитов может быть объяснена дисперсией величины ФА.
Рис. 14. Зависимость числа лейкоцитов в периферической крови зеленых лягушек от величины флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков.
Результаты непараметрического метода сравнения первичных экспериментальных данных по критерию Крускала-Уоллеса и медианному тесту позволяют отклонить нулевую гипотезу об отсутствии различий групп и принять альтернативную гипотезу о различии между группами по всем основным показателям лейкограмм (табл.5). В периферической крови зеленых лягушек, обитающих в условиях II балла качества среды, фоне общей лейкопении, уменьшается доля нейтрофилов за счет палочкоядерных форм. В условиях среднего уровня отклонения качества среды от нормы (III балл) изменения качественных характеристик всех типов лейкоцитов более выражены. Лейкоцитарная формула характеризуется возрастанием доли эозинофилов, базофилов и уменьшением доли лимфоцитов. Наблюдаемый при этом сдвиг в формуле клеток «влево» свидетельствует о резком подавлении защитных сил и истощении костно-мозговых резервов нейтрофилов.
Таблица 5 Лейкоцитарный состав периферической крови амфибий урбанизированных территорий
|
Показатель |
Средняя взвешенная показателя для обобщенной группы (%) |
Значение критерия Крускала-Уоллеса(H), медианный тест (ч2) |
|||||
|
1 группа (I балл качества среды) |
2 группа (II балл качества среды) |
3 группа (III балл качества среды) |
4 группа (IV балл качества среды) |
5 группа (V балл качества среды) |
|||
|
Нейтрофильные гранулоциты |
15,67±0,46 (n=96) |
13,78±0,53 (n=147) |
16,56±1,11 (n=54) |
13,32±0,46 (n=95) |
13,68±0,47 (n=110) |
H=18,59, p=0,0009; ч2=16,25, р=0,0027 |
|
|
Эозинофильные гранулоциты |
7,53±0,33 (n=96) |
10,01±0,66 (n=148) |
10,66±0,94 (n=55) |
6,16±0,53 (n=94) |
6,09±0,3 (n=110) |
H=34,98, p<0,001; ч2=28,13, p<0,001 |
|
|
Базофильные гранулоциты |
6,39±0,45 (n=90) |
7,42±0,52 (n=137) |
11,92±0,92 (n=55) |
2,09±0,14 (n=96) |
3,08±0,182 (n=110) |
H=125,96, p<0,001, ч2=102,13, p<0,001 |
|
|
Моноциты |
2,18±0,201 (n=96) |
1,83±0,169 (n=137) |
2,41±0,44 (n=54) |
4,02±0,3 (n=95) |
3,20±0,18 (n=110) |
H=78,58, p<0,001; ч2=45,39, p<0,001 |
|
|
Лимфоциты |
67,66±0,46 (n=96) |
65,28±1,05 (n=147) |
57,56±1,21 (n=55) |
73,95±0,66 (n=95) |
74,07±0,57 (n=110) |
H=116,13, p<0,001; ч2=62,95, p<0,001 |
При существенных (значительных) отклонениях качества среды от нормы (IV балл) и в условиях критического состояния среды обитания (V балл) в белой крови лягушек наблюдается уменьшение доли нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, возрастание числа моноцитов и лимфоцитов. Возрастание доли агранулоцитов свидетельствует о напряжение иммунных реакций организма и, по-видимому, обеспечивает адаптацию амфибий к существованию в условиях загрязнения. Наряду с деструктивными процессами имеют место и компенсаторно-восстановительные реакции, проявляющиеся в активации кроветворения (возрастание числа молодых форм гранулоцитов).
Анализ зависимости количества лимфоцитов периферической крови от величины флуктуирующей асимметрии показал, что примерно на 58% (показатель детерминации R2=0,58) дисперсия количества лимфоцитов может быть объяснена дисперсией величины ФА. Коэффициент корреляции Спирмана между этими показателями составляет (r=0,76; p=0,0001) и характеризует статистическую связь между анализируемыми показателями (рис.15).